Summary
Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri içeren, protokoller açıklamaktadır.
Abstract
Membran proteinleri (MP) gibi özel moleküller, tüm hücre ve organeller çevreleyen başka geçirimsiz membran bilayeri üzerinden pompalama gibi birçok fizyolojik süreçler kritik bir rol oynar. Birçok insan hastalık ve bozukluklar milletvekilleri sonucu işlevini değişiklikler; böylece, yapıları karmaşık bir anlayış, biyolojik araştırmalar için kritik bir hedefi olmaya devam ediyor. Ancak, milletvekillerinin yapı tayini genellikle hidrofobik kaynaklanan önemli bir sorun olmaya devam etmektedir.
Milletvekilleri bilayeri içinde gömülü önemli hidrofobik bölgelerde var. Deterjanlar sonra çözünür proteinler gibi benzer bir şekilde manipüle edilebilir bir protein-deterjan üreten Misel bilayeri sık sık bu proteinlerin çözünür kullanılır. Geleneksel olarak, kristalizasyon çalışmalarda bir protein-deterjan karışımı kullanarak devam edin, ama genellikle kristalleşme karşı veya kalitesiz kristaller üretmek. Bu sorunlar nedeniyle ortaya çıkandeterjan yetersizliği yeterince kötü istikrar ve heterojenite ile sonuçlanan bilayeri taklit etmek. Buna ek olarak, deterjan kalkanlar MP hidrofobik yüzey kristal kişiler için yüzey alanı azaltır. Aşmak için bu sakıncaları milletvekilleri, daha yakından, endojen ortamını uyaran lipidik medya, kristalize olması, ve son zamanlarda MP kristalizasyon için de novo tekniği haline gelmiştir.
Lipidik kübik faz (LCP) sulu kanal 1 bir enterkonnekte sistem tarafından nüfuz üç boyutlu çift katlı lipid. Monoolein seçim lipid olmasına rağmen, ilgili lipidler gibi monopalmitolein ve monovaccenin olarak da LCP 2 yapmak için kullanılır olmuştur. Milletvekilleri, üç boyutlu ve yem kristal çekirdekleri diffüz LCP içine dahil edilmiştir. LCP en büyük avantajı, protein, daha doğal bir ortamda kalmasını, ancak yöntem yüksek visc de dahil olmak üzere bir dizi teknik dezavantajları vardırosity (uzman aparatları gerektiren) ve kristal görselleştirme ve manipülasyon 3,4 zorluklar. Çünkü bu teknik zorluklar, kristalizasyon-bicelles 5,6 (Şekil 1) için başka bir lipidik orta kullandı. Bicelles amphiphile (CHAPSO) ya da kısa zincirli yağ (DHPC) ile fosfatidilkolin lipid (DMPC) harmanlayarak oluşturduğu lipid / amphiphile karışımları. Amphiphile molekülleri hattı apolar kenarları bilayers ve deterjanlar hem de faydalı özellikleri sunarken, her bicelle disk içerisinde lipid molekülleri bilayeri oluşturmak. Önemlisi, kendi geçiş sıcaklığı altında, protein bicelle karışımları, düşük viskozite ve kristalizasyon robotlar ile bicelles uyumlu hale getirir, deterjan-çözünür milletvekilleri benzer bir şekilde manipüle edildi.
Bicelles birkaç zarı proteinleri 5,7-11 (Tablo 1) kristalize başarıyla kullanılmaktadır. Bu kolleksiyonuproteinler, alfa sarmal ve beta yaprak milletvekilleri hem de prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan kristalize için bicelles çok yönlülüğünü gösteriyor. Çünkü bu başarıları ve yüksek verimli uygulama basitliği, bicelles her membran proteini kristalbilimciydi cephaneliğinin bir parçası olmalıdır. Bu video, bicelle yöntemini açıklar ve standart robotik kullanarak milletvekilleri saflaştırılmış, yüksek verimli kristalizasyon çalışmalarda kurmak için bir adım-adım protokolü sağlamak.
Protocol
I) bir bicelle şekillendirme lipid hazırlığı:: Bicelle tabanlı kristalizasyon dört temel adımdan oluşur (Şekil 2); ii) bicelle ortama saflaştırılmış protein eklenmesi, iii) kristalizasyon çalışmalarda (manuel veya robot), amphiphile karışım ve iv) görselleştirme, kristal çıkarma ve dondurma. Bu adımlar aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
1. Bicelles, hazırlanması
Amphiphile kombinasyonları ve konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede üzerinde Bicelles lipid çeşitli oluşabilir. Bu nedenle, bir başlangıç kompozisyon tabanlı önceki başarılı (Tablo 1) önerilen koşullarda-. (Bkz. aşağıda Reaktifler Tablo) ve bir önceden karıştırılmış kullanıma hazır formülasyonu olarak ticari olarak satın alınan veya açıklandığı gibi laboratuarda hazırlanan CHAPSO bicelle formülasyonu, en başarılı karışımı DMPC. 2.8:1 molar oranında CHAPSO karışımı: Bu egzersiz için 1 ml% 35 DMPC hazırlayacaktır.
- Bicelle yüzdesi ile -40% 10 arasında değişebilir DMPC: 2.6-3.0:1 (Tablo 1) arasında değişen CHAPSO molar oranı.
- Not: bicelle konsantrasyonu daha zor, daha yüksek bir çözüm viskozite elde lipid çözmek için ne kadar yüksek . Ancak, konsantre bir bicelle formülasyonu protein konsantrasyonu düşük olduğunda avantajlı olabilir.
- Lipid eriterek homojen bir çözüm elde etmek için bu adımı, bicelle yöntemi tüketen çoğu zaman, önemli çaba gerektirir. DMPC kadar aşağıdaki adımları arasında geçiş yapma tamamen karışık:
- Sıcak karışım ~ 40 ° C su banyosu ya da bir kuluçka makinesi ve yaklaşık 1 dakika için girdap.
- Not: daha fazla devir yürütülmektedir olarak, jel benzeri bir con karışımı ısınma neden olacaktırsistency zor girdap.
- Birkaç dakika için buz ve vorteks karışımı soğutun. Soğutma girdabına kolaylaştırarak çözüm sıvılaştırılması yardımcı olur.
- Not: daha fazla devir yapılır, karışım soğutma üzerine bulutlu olabilir.
- Lipid tamamen eriyene kadar (1.2.1 ve 1.2.2) yukarıda sıralanan adımları tekrarlayın.
- Not: Bu işlem birkaç saat sürebilir. CHAPSO formülasyonu: Bicelle oluşumu DMPC faz davranış değişiklikleri ile gösterilir. Tamamlanmasından sonra, karışım net bir jel üstünde veya oda sıcaklığında viskoz sıvı ve buz üzerinde olacaktır.
- Sıcak karışım ~ 40 ° C su banyosu ya da bir kuluçka makinesi ve yaklaşık 1 dakika için girdap.
- Bicelle karışımı artık kullanıma hazır hale gelir ve uzun süreli saklama (5 yıla kadar) için -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Fosfolipid baş grup hidroliz riski nedeniyle, uzun süre oda sıcaklığında bicelles saklamak için tavsiye edilmez.
2. Bicelles içine protein Incorporation
Bicelles den elde edilen MP yapıları DMPC kristalize edilmiştir: CHAPSO bicelle konsantrasyonu% 2 ila% 8 arasında değişen 8 ila 12 mg / ml (Tablo 1) bir protein konsantrasyonu kullanarak. Mümkünse, ilk ekranlarında bu yönergelere kullanmanız gereken ve ek konsantrasyonları optimizasyon aşamasında taranabilen. LCP yöntemi ile karşılaştırıldığında, protein eklenmesi ile bicelles kristalizasyon çalışmalarda aynı gün yapılmalıdır (Şekil 3), basit bir işlemdir.
- CHAPSO bicelle net bir jel faz değişene kadar oda sıcaklığında karışımı: DMPC çözülme.
- Not: Birden fazla donma-çözülür bicelle davranışını etkilemez.
- Liquify ve homojen bir bicelle faz yeniden kurmak için kısaca girdap buz karışımı yerleştirin. Buz üzerinde konulduğunda karışımı bulutlu olabilir.
- From bu noktada, bicelle karışımı tutmak ve buz üzerinde saflaştırılmış protein. Bu pipetleme için mükellef bir sıvı faz bicelle devam edecektir.
- 01:04 (V / V) oranında saflaştırılmış deterjan-çözünür protein bicelle karışımı ekleyin.
- Örneğin: 100 ul bicelle protein karışımı, 20 ul bicelle ile 80 ul protein karıştırılması ile elde edilir. Protein konsantrasyonu 15 mg / ml 'dir ve bicelle konsantrasyonu% 35 ise, bu bir protein konsantrasyonu 12 mg / ml ve% 7 oranında bir bicelle konsantrasyon ile anonim bir bicelle-protein karışımının verecektir.
- Çözelti berrak ve homojen hale gelinceye kadar yavaşça içeriğini pipetleme ve aşağı çevirerek karıştırın.
- Not: kabarcıklar belirirse, bir masaüstü santrifüj ile hızlı bir spin (30-60 saniye, 13000 rpm, 4 ° C) bunları kaldırmak yardımcı olabilir.
- Protein int tam birleşme teşvik etmek için en az 30 dakika buz karışımı inkübeo bicelles. Protein bicelle karışımı kristalizasyon denemeleri için hazırdır.
3. Kristalizasyon denemeler ayarlama
LCP gibi diğer lipid kristalizasyon teknikleri, orta yüksek viskozite nedeniyle özel ekipman gerektiren, ancak bicelles eşsiz faz davranışları, robotik (Şekil 3) de dahil olmak üzere hemen hemen herhangi bir standart bir kristalizasyon formatı uygulamaya izin verir. Kristalizasyon çalışmalar ya piyasada bulunan standart ekranlarını kullanarak damla formatları asılı veya oturarak yapılabilir.
- Olsun, bir kristalizasyon robot elle tepsi veya buz üzerinde bicelle protein karışımı korumak. Bu protein bicelle karışımı soğuk tutmak ve çözüm viskozite en az olmasını sağlamak olacaktır.
- Manuel Kristalizasyon Denemeler - standart bir pipet kullanarak, normalde protein bicelle karışımı gerçekleştirmek olarak aynı şekilde rezervuar çözümü ile karıştırılabilir.çözünür veya deterjan-çözünür zarı proteinleri ed.
- Not: çalışmalar sırasında, protein bicelle karışımı buz tutun .
- Robotik Kristalizasyon Denemeler - Biz bu çalışmaların Sivrisinek kristalizasyon robot için hazırlanmış, ancak prensip olarak (aynı aşağıdaki önlemler) tekniği, tüm kristalizasyon robotlar ile uyumlu olmalıdır . Aşağıdaki ipuçları, protein bicelle karışımı serin kalır ve doğru bir robot tarafından pipetlenir sağlayacaktır:
- Ğutma bicelle protein karışımı buz üzerine yerleştirerek tutan plaka.
- Plakasına protein bicelle karışımı Pipet ve plaka buz tutmaya devam ediyor. Bu plaka, kaçak başlamadan önce robot gitmek için son öğe olmalıdır.
- Sivrisinek robot platformu 3 ve 5 sırasıyla rezervuar tepsisi ve kristalizasyon kapakları, set-up.
- Platformu 4 protein bicelle karışımı içeren plaksivrisinek robot. Bu protein bicelle karışımı robot tarafından yakalandı son sağlar ve hemen serbest bırakılır.
- Isıtma ve artan viskozite önlemek için, protein bicelle karışımı ile rezervuar karışmaz.
- Birden fazla ekranı yaparken, hemen bir çalışma tamamlandıktan kısa sürede soğutmak için buz bicelle protein plaka dönüş.
- Bırak hacmi ve oranı (protein: rezervuar), geleneksel kristalizasyon denemeleri için olarak seçilebilir. Bicelle karışımı artı 0.25 ul rezervuar: Örneğin, Sivrisinek robot kullanarak ilk kristal çalışmalarda 0.25 ul proteini kullanarak kurmak olabilir.
- 20 odasında kristal çalışmalarda inkübe ° C Sıcaklık bicelles faz davranışı sıcaklığa bağlıdır çünkü, iyi bir tarama ve optimizasyon parametresi.
- Yüksek sıcaklıklar öncesi organize bir avantaja sahiptir lameller faz 12 (Şekil 1), nedenkatmanlar halinde protein. 20 altındaki sıcaklıklarda ° C gösterildi olabilir, fakat bu yana C, uzun süre üzerinde çökelti lipidler neden olabilir ° 4'ün altında gitmemelidir.
- Bicelle çalışmalarda geleneksel kristalizasyon çalışmalarda aynı şekilde, kristal görünümü ve büyüme için düzenli olarak izlenmelidir. 1. ve 3. gün sonrası kurulum haftalık inceleme yoluyla takip tepsileri kontrol etmenizi öneririz.
- Kristal optimizasyonu, ızgara tarama, katkı tarama Ayrıca, değişen sıcaklıklarda vb, bicelle yüzdesi ve protein içeren deterjan bazlı kristalleri için rutin olarak kullanılan yöntemler kullanılarak yapılabilir: bicelle oranı çeşitli olabilir. Ayrıca, protein istikrar ya da fonksiyon için gerekli olabilir belirli lipidler bicelles katkılı olabilir.
4. Görselleştirme, kristal çıkarma ve dondurma
Bicelle protein karışımı ile kristal denemeleri bu yana protein-deterjan damla, görselleştirme ve kristal çıkarımı için benzer bir viskozite rutin ve geleneksel set-up gibi yapılmaktadır.
- Görselleştirme: kristal algılama için sık sık normal ve polarize ışık altında yüksek kaliteli aydınlatma gerektirir LCP medya aksine, görselleştirme bicelles engel değildir. Renkli yanı sıra renksiz protein kristal damla standart mikroskoplar ve hiçbir özel ekipman gerektirmez kullanarak kolayca analiz edilebilir.
- Bicelles, diğer lipidik medya gibi, yanlış pozitif bir yüksek orandaki üretme eğilimindedir. UV mikroskop, tuz kristalleri (Şekil 4) protein ayırmada büyük ölçüde yardımcı olur.
- Ekstraksiyon ve Donma: Kristal çıkarma ve dondurma oldukça basittir ve çevresindeki bicelle medya dağılması gerektirmez. Ayrıca, bicelle aşamasında kendini bazı ılımlı cryo koruma sağlar.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
nt> genellikle görünür ve onları maksimum boyutuna büyümek için yaklaşık bir hafta veya daha fazla kristalleri için 2-3 gün sürer. bacteriorhodopsin ve fare voltaj bağımlı anyon kanalı 1 (mVDAC1) kristalleri 4,8 olduğu Diğer zarı proteinleri için kristal büyümesi için birkaç hafta alabilir, bu yüzden ilk haftalarda iyi ötesinde kristal denemeleri izlemeye devam etmek önemlidir.Bicelles diğer lipidik medya gibi, kristal olarak görünebilir şekiller oluşturma eğilimindedir. Aynı zamanda daha yüksek bir oranda tuz ve deterjan kristalleri yol açtığı gözlenmiştir. Triptofan floresans algılayan A, UV-mikroskop gibi non-protein "false positive" (hatalı tespit) önemli ölçüde ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Şekil 4 farklı sonuçlar görülebilir ayırt edilmesine yardımcı olmak için, görünür ve UV ışık görüntülenebilir lipid şekiller, tuz ve protein kristaller gösterir.
83fig1.jpg "/>
Şekil 1 Bicelle şematik. Bicelles DMPC (mavi) ve bilayeri hidrofobik kenarları koruyan CHAPSO (yeşil), gibi bir amphiphile bilayeri oluşturan lipid molekülünün oluşmaktadır. Sıcaklık arttıkça, disk gibi bicelles delikli lameller sayfa 12 içine bir faz değişim geçirmiştir.
Şekil 2, dört temel adımları özetleyen bicelle kristalizasyon yöntemi için Akış Şeması .
Şekil 3. Kristal çalışmalarda set-up şematik. Saf deterjan-çözünür zarı proteinleri birlikte içeriğini pipetleme doğrudan buz üzerinde bicelles ile karışık olabilir. ~ 30 dakika, kristalizasyon denemeleri için buz üzerinde protein / bicelle karışımı inkübe sonrarobotik dahil olmak üzere herhangi bir standart format kullanılarak kurulabilir.
Şekil 4 kristal çalışmaların Görselleştirme. (A) tuz-tek şart gözlenen İğne şeklindeki kristal görünür görüntü (üst panel) ve UV (alt panel). Hiçbir floresan, kristaller yanlış pozitif bir göstergesi tespit edilebilir. (B) Çubuk şeklindeki kristal bir MPD durum oluşturdu. Kristal zayıf fluoresced ancak, X-ışını kırınımı kullanarak non-protein olduğu tespit edildi. (C) Kristal çalışmalarda kurma sonra yaklaşık dört hafta gözlenmektedir. UV ışığı altında güçlü floresan bir protein kristal onaylar.
| Hayır. | Protein | Kaynak | Bicelle Formülasyon | Concentrati Proteinüzerinde | Deterjan 1 | Çözünürlük (Å) | Referans |
| 1 | Bacteriorhodopsin 2 | Halobacterium salinarum | % 8 DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 8 mg / ml | 2,0 | Faham ve Bowie, 2002 | |
| % 8 DTPC: CHAPSO (3:1) | 8 mg / ml | 1,8 | Faham ve ark, 2005 | ||||
| 2 | β2-adrenerjik reseptör / Fab kompleksi | Homo sapiens | % 8.3 DMPC: CHAPSO (3:1) | 10 mg / ml | DDM | 3.4/3.7 | Rasmussen ve ark, 2007 |
| 3 | Voltaj-bağımlı anyon kanal 1 | Mus musculus | % 7 DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 12 mg / ml | LDAO | 2,3 | Ujwal ve ark, 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | % 4.2 DMPC,% 5 NM | 4 mg / ml | DDM | 1,9 | Luecke ve ark, 2009 |
| 5 | Rhomboid proteaz | Escherichia coli | % 2 DMPC: CHAPSO (2.6:1) | 9 mg / ml | Nonil glucoside | 1,7 | Vinothkumar, 2011 |
Membran protein saflaştırılması için kullanılan 1 Deterjan
Mor membranlar 2 Native lipidler arıtma sırasında birlikte yapılabilir
Tablo 1. Membran protein yapıları için kristalizasyon koşullarını Özeti bicelles kullanarak çözdü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bicelles eşsiz bir lipidik medya deterjanların çözünür gibi davranmaya gibi yerli çift katlı bir ortam sunuyoruz. Bu özellik, herhangi bir öğrenme eğrisi ya da bu tekniği için gerekli olan özel ekipman olmadığından bicelles diğer lipid tabanlı kristalizasyon yöntemleri üzerinde ayrı bir avantaj sağlar. Bicelles, ticari ya da laboratuarda hazırlanan mevcuttur, kristalizasyon çalışmalarda neredeyse tam standart deterjan bazlı protokolleri ile devam saflaştırılmış protein ve bu noktadan itibaren doğrudan karışık olabilir. Ayrıca, bicelles standart robotik ve rutin görselleştirme ve kristal çıkarımı kullanarak genişletilmiş depolama süreleri, basit protein uygunlanmak, yüksek verim yeteneği de dahil olmak üzere, diğer tekniklerle karşılaştırıldığında birkaç pratik avantajlar sunuyoruz. Bir başka belirgin bir avantaj optimizasyonu için özel lipidler ile uyuşturucu bicelles yeteneğini veya ilgi protein için faydalı gösterildiği takdirde. Birlikte ele alındığında, Lipi'dandic bicelle yöntemi, tüm membran protein kristalizasyon projeler için kolayca uyarlanamıyor, pratik kullanım kolaylığı ile birlikte önemli bir çok yönlülük sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. James Bowie ve Salem Faham bicelle yöntemi ve faydalı tartışmalar için Dr. Aviv Paz teknik uzmanlık ve rehberlik sağlamak için. Biz deneysel destek için Le Du kabul etmiş sayılırsınız. Rachna Ujwal Ancak, bu işe destek vermedi, MemX Biosciences LLC mali çıkarı var. Bu çalışma NIH (RO1 GM078844) hibe kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
