Summary
Bicelles är lipid / amphiphile blandningar som upprätthåller membranproteiner (MPS) inom en membranet men har unika fasbeteende som underlättar high-throughput screening genom kristallisering robotar. Denna teknik har framgångsrikt producerat ett antal högupplösta strukturer från både prokaryota och eukaryota källor. Denna video beskriver protokoll för att generera lipidic bicelle blandningen, försedda parlamentsledamöter i bicelle blandningen, inrättande crystallizations studier (såväl manuellt som robot) och kristaller upptagning från mediet.
Abstract
Membranproteiner (MPS) spelar en avgörande roll i många fysiologiska processer såsom pumpning specifika molekyler över den annars ogenomträngliga membranet tvåskiktsmembran som omger alla celler och organeller. Förändringar i funktion riksdagsledamöter resultera i många mänskliga sjukdomar och störningar, och därför är en intrikat förståelse för deras strukturer en avgörande mål för biologisk forskning. Dock fortfarande strukturbestämning av riksdagsledamöterna en betydande utmaning ofta härrör från deras hydrofobicitet.
Riksdagsledamöter har stora hydrofoba regioner inbäddade i tvåskiktsmembran. Rengöringsmedel används ofta för att löses dessa proteiner från tvåskiktsmembran generera en protein-diskmedel micellen som sedan kan manipuleras på samma sätt som lösligt protein. Traditionellt kristallisering försök gå vidare med en protein-rengöringsmedel blandning, men ofta motstånd kristallisering eller producera kristaller av dålig kvalitet. Dessa problem uppstår på grund avrengöringsmedel oförmåga att tillräckligt efterlikna tvåskiktsmembran vilket ger dålig stabilitet och heterogenitet. Dessutom rengöringsmedel skyddar hydrofoba yta MP minska ytan för kristall kontakter. För att kringgå dessa nackdelar parlamentariker kan kristalliseras i lipidic media, som bättre simulerar sin endogena miljö, och har nyligen blivit en de novo-teknik för MP kristallisering.
Lipidic kubisk fas (LCP) är en tredimensionell membranet penetrerad av ett sammanlänkat system av kammarvatten kanaler 1. Även monoolein är det fett som föredras, har anknytning lipider som monopalmitolein och monovaccenin också använts för att göra LCP 2. Riksdagsledamöter har införlivats med LCP där de diffusa i tre dimensioner och foder kristall kärnor. En stor fördel med LCP är att proteinet blir kvar i en mer ursprungliga miljö, men metoden har ett antal tekniska nackdelar inklusive hög viscosity (som kräver specialiserade apparater) och svårigheter i kristall visualisering och manipulering 3,4. På grund av dessa tekniska svårigheter, utnyttjade vi en annan lipidic medium för kristallisering-bicelles 5,6 (figur 1). Bicelles är lipid / amphiphile blandningar bildas genom att blanda en fosfatidylkolin lipider (DMPC) med en amphiphile (CHAPSO) eller en kort kedja lipider (DHPC). Inom varje bicelle skiva, lipidmolekyler generera en tvåskiktsmembran medan amphiphile molekylerna linjen icke-polära kanterna ger välgörande egenskaperna hos både bilayers och rengöringsmedel. Viktigt under deras övergång temperatur, protein-bicelle blandningar har en minskad viskositet och manipuleras på ett liknande sätt som rengöringsmedel-solubilized parlamentsledamöter, vilket gör bicelles kompatibel med kristallisering robotar.
Bicelles har med framgång använts för att kristallisera flera membranproteiner 5,7-11 (tabell 1). Denna växande samlingav proteiner visar mångsidigheten hos bicelles för kristalliserande både alfa spiralformade och beta parlamentariker plåt från prokaryota och eukaryota källor. På grund av dessa framgångar och enkelheten i hög genomströmning genomförandet bör bicelles ingå i varje membranprotein crystallographer arsenal. I denna video beskriver vi bicelle metodik och ger en steg-för-steg-protokollet för att upprätta hög genomströmning kristallisation prövningar av renat riksdagsledamöter med vanliga robotar.
Protocol
Bicelle baserade kristallisering består av fyra steg (figur 2): i) utarbetande av en bicelle bilda fett: amphiphile blandning, ii) integrering av renat protein i bicelle medium, iii) crystallization prövningar (manuellt eller robot), och iv) visualisering, kristall utvinning och frysning. Dessa steg beskrivs i detalj nedan
1. Beredning av Bicelles
Bicelles kan bildas i en mängd olika lipid: amphiphile kombinationer och över ett brett spektrum av koncentrationer. Därför är förhållanden-en ursprungliga sammansättningen baserad på tidigare framgångsrika rekommenderas (tabell 1). Den mest framgångsrika blandningen är DMPC: CHAPSO bicelle formulering, som antingen kan köpas kommersiellt som en färdigblandad färdig att använda formuleringen (se tabell av reagenser nedan) eller upprättats i labbet som beskrivs. För denna övning kommer vi att förbereda 1 ml 35% DMPC: CHAPSO blandningen på ett 2.8:1 molförhållandet.
- Den bicelle andelen kan variera mellan 10% -40% med en DMPC: CHAPSO molförhållandet från 2.6-3.0:1 (tabell 1).
- Observera: Ju högre bicelle koncentration desto svårare är det att upplösa lipid resulterar i en högre lösning viskositet. Däremot kan en koncentrerad bicelle formulering vara en fördel när det protein koncentrationen är låg.
- Lösa upp fett för att erhålla en homogen lösning kräver mycket arbete, vilket gör detta steg den mest tidskrävande i bicelle metoden. Cykla genom följande steg tills DMPC är helt blandat:
- Värm blandningen till ~ 40 ° C med ett vattenbad eller en inkubator och vortexa för ~ 1 minut.
- Obs: När fler cykler utförs, kommer uppvärmningen blandningen resulterar i en gel-liknande consistency gör det svårt att skaka.
- Kyl blandningen på is och skaka i några minuter. Kylning hjälper vätskeform lösningen gör det lättare att virvel.
- Obs: När fler cykler utförs, kan blandningen bli grumlig vid nedkylning.
- Upprepa stegen ovan (1.2.1 och 1.2.2) tills fett är helt upplöst.
- Obs: Den här processen kan ta flera timmar. Bicelle formation indikeras av förändringar i fas beteende DMPC: CHAPSO formulering. Efter avslutad, kommer blandningen en klar gel vid eller över rumstemperatur och en trögflytande vätska på is.
- Värm blandningen till ~ 40 ° C med ett vattenbad eller en inkubator och vortexa för ~ 1 minut.
- Den bicelle Blandningen är nu klar att använda och kan förvaras vid -20 ° C för långtidsförvaring (upp till 5 år). På grund av risken för hydrolys av fosfolipid huvudet gruppen är det inte tillrådligt att förvara bicelles vid rumstemperatur under längre perioder.
2. Införlivandet av protein i bicelles
De flesta MP strukturer från bicelles var kristalliserad i DMPC: CHAPSO bicelle koncentration från 2 till 8% med hjälp av ett protein koncentration av 8 till 12 mg / ml (tabell 1). Om möjligt bör inledande skärmar använda dessa riktlinjer och ytterligare koncentration kan siktas vid optimering skede. Jämfört med LCP-metoden, är protein införlivande med bicelles en enkel process (Figur 3), vilket bör göras samma dag som kristallisering prövningar.
- Tina DMPC: CHAPSO bicelle blandning vid rumstemperatur tills den fas ändras till en klar gel.
- OBS: Flera frysa tinar kommer inte att påverka bicelle beteende.
- Lägg blandningen på is till smält och kort virvel att återupprätta en homogen bicelle fas. När de placeras på is blandningen kan bli grumligt.
- FrOm denna punkt på, håll bicelle blandningen och renat protein på is. Detta håller bicelle i en vätskefas gör det mottaglig för pipettering.
- Tillsätt bicelle blandningen till den renade tvättmedel-solubilized protein i en 1:4 (v / v) förhållandet.
- Till exempel: 100 l protein-bicelle blandning erhålls genom att blanda 80 l protein med 20 l bicelle. Om det protein koncentrationen är 15 mg / ml och bicelle koncentration är 35%, kommer detta att ge en bicelle-införlivas protein blandning med en protein koncentration av 12 mg / ml och en bicelle koncentration på 7%.
- Blanda genom att försiktigt pipettera innehållet upp och ner tills lösningen blir klar och homogen.
- Observera: Om bubblor syns, kan en snabb spin (30-60 sekunder, 13000 rpm, 4 ° C) med en bordsskiva centrifug bidra till att undanröja dem.
- Inkubera blandningen på is i minst 30 min för att främja fullständig integrering av protein into bicelles. Det protein-bicelle blandning är nu klar för kristallisering prövningar.
3. Ställa in kristallisering prövningar
Andra lipid kristallisering tekniker som LCP kräver specialutrustning på grund av mediets hög viskositet, men den unika fas beteende bicelles tillåter genomförande i stort sett alla vanliga kristallisering format inklusive robotik (Figur 3). Kristallisering försök kan utföras i antingen hängande eller sittande släppa format med hjälp av vanliga kommersiellt tillgängliga skärmar.
- Oavsett om inrättande brickor manuellt eller med hjälp av en kristallisering robot, upprätthålla protein-bicelle blandningen på is. Detta håller protein-bicelle blandningen kallt och se till att lösningsviskositet är minimal.
- Manuell Kristallisering Trials - Med en vanlig pipett, kan protein-bicelle blandningen blandas med reservoar lösning på samma sätt som normalt utförED för lösliga eller rengöringsmedel-solubilized membranproteiner.
- Anmärkning: Behåll protein-bicelle blandningen på is under försöken.
- Robotic Kristallisering Trials - Vi har anpassat dessa prövningar för Mosquito kristallisering roboten, men i princip (enligt samma försiktighetsåtgärder) att tekniken bör vara kompatibel med alla kristallisering robotar. Följande tips kommer att säkerställa att protein-bicelle blandningen är sval och exakt pipetteras av roboten:
- Förkyla plattan håller protein-bicelle blandningen genom att placera den på is.
- Pipettera protein-bicelle blandningen i plattan och fortsätta att hålla plattan på is. Denna platta ska vara den sista posten för att gå på roboten innan man börjar springa.
- Set-up reservoaren fack och lock kristallisering på plattform 3 respektive 5 av mygga roboten.
- Placera plattan innehåller protein-bicelle blandningen på plattform 4av mygga roboten. Detta försäkrar att protein-bicelle blandningen är den sista som plockas upp av roboten och det är omedelbart friges.
- För att förhindra värme och ökad viskositet, blanda inte behållaren med protein-bicelle blandning.
- När du utför flera skärmar, omedelbart returnera bicelle-protein platta till is för kylning så snart en körning är avslutad.
- Drop volym och ratio (protein: reservoar) kan väljas som för konventionella kristallisering prövningar. Till exempel kan första kristall försök med Mosquito roboten måste konfigureras med 0,25 l protein: bicelle blandning plus 0,25 l reservoar.
- Inkubera kristallen prövningar i en kammare vid 20 ° C. Temperaturen är en bra screening och optimering parameter eftersom den fas beteende bicelles är temperaturberoende.
- Högre temperaturer inducera lamellära fasen 12 (Figur 1), som har fördelen av pre-organiseraproteinet i lager. Temperaturer under 20 ° C kan kontrolleras, men du bör inte gå under 4 ° C eftersom detta kan orsaka att lipider att fälla under långa tidsperioder.
- På samma sätt som traditionella kristallisering prövningar bör bicelle prövningar övervakas regelbundet för Crystal utseende och tillväxt. Vi rekommenderar att kolla magasin på 1: a och 3: e dagen efter installationen följt av veckovisa inspektioner.
- Crystal optimering kan utföras med metoder som rutinmässigt används för rengöringsmedel baserade kristaller inbegripet GRID screening, additiv screening, förändrade temperaturer etc. Dessutom bicelle procent och protein: bicelle förhållandet kan varieras. Dessutom kan bicelles vara dopad med specifika lipider som kan vara nödvändigt för protein stabilitet eller funktion.
4. Visualisering, kristall utvinning och frysning
Eftersom kristall försök med protein-bicelle blandning har en viskositet liknande protein-rengöringsmedel droppar, visualisering och kristall utvinning är rutin och genomförs som traditionell set-ups.
- Visualisering: I motsats till LCP media som ofta kräver hög kvalitet belysning under normala och polariserat ljus för Crystal upptäckt, är visualisering inte hindras av bicelles. Färgade och färglös protein kristall droppar kan enkelt analyseras med hjälp av vanliga mikroskop och ingen speciell utrustning krävs.
- Bicelles, liksom andra lipidic medier tenderar att producera en hög andel falska positiva. En UV-mikroskop bidrar i hög grad att skilja protein från saltkristaller (Figur 4).
- Extraktion och Frysning: Crystal utvinning och frysning är relativt enkelt och kräver inte upplösningen av den omgivande bicelle media. Dessutom ger bicelle fas sig några moderata Cryo-skydd.
5. Representativa resultat:
nt "> Det tar vanligtvis 2-3 dagar för kristaller ska visas och ca en vecka eller mer för dem att växa till sin maximala storlek. Detta var fallet för bacteriorhodopsin och mus spänningsberoende anjon kanal 1 (mVDAC1) kristaller 4,8 . För andra membranproteiner kan det ta flera veckor för kristall tillväxt, så det är viktigt att fortsätta övervakningen av kristallen prövningar långt efter de första veckorna.I likhet med andra lipidic medier bicelles tenderar att bilda former som kan tyckas vara kristallina. Det har också konstaterats att de leder till en högre andel av salt och kristaller diskmedel. En UV-mikroskop som upptäcker tryptofan fluorescens kan avsevärt bidra till att undanröja sådana icke-proteinhaltig falska positiva. Figur 4 visar lipid former, salt och kristaller protein som visas i synligt och UV-ljus för att särskilja de olika resultat som kan observeras.
83fig1.jpg "/>
Figur 1. Bicelle Schematisk. Bicelles består av en tvåskiktsmembran bilda lipid molekyl som DMPC (blå) och en amphiphile som CHAPSO (grön), som skyddar de hydrofoba kanter tvåskiktsmembran. När temperaturen höjs, disc-liknande bicelles genomgår en fas omvandling till en perforerad lamellär plåt 12.
Figur 2. Flödesschema för bicelle kristallisering metoden beskriver de fyra grundläggande stegen.
Figur 3. Crystal försök set-up schematisk. Renat tvättmedel-solubilized membranproteiner kan direkt blandas med bicelles på is genom att pipettera innehållet tillsammans. Efter inkubering av protein / bicelle blandningen på is för ~ 30 minuter, kristallisering prövningarkan ställas in med någon standardformat inklusive robotik.
Figur 4. Visualisering av kristall prövningar. Synlig bild (övre panelen) och UV-bild (undersidan) av (A) Needle-formade kristaller observerats i en salt-enda villkoret. Ingen fluorescens kan detekteras från kristaller, ett tecken på falskt positiva. (B) stavformade kristaller bildas i en MPD skick. Kristallen fluoresced svagt, men visade sig vara icke-proteinhaltig med röntgendiffraktion. (C) Crystal observeras ungefär fyra veckor efter att inrätta prövningar. Den starka fluorescens i UV-belysning bekräftar att det är ett protein kristall.
| Nej. | Protein | Källa | Bicelle Formulering | Protein Concentratipå | Rengöringsmedel 1 | Upplösning (Å) | Referens |
| 1 | Bacteriorhodopsin 2 | Halobacterium salinarum | 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 8 mg / ml | 2,0 | Faham och Bowie, 2002 | |
| 8% DTPC: CHAPSO (3:1) | 8 mg / ml | 1,8 | Faham et al. 2005 | ||||
| 2 | β2-adrenerga receptor / Fab komplex | Homo sapiens | 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) | 10 mg / ml | DDM | 3.4/3.7 | Rasmussen et al. 2007 |
| 3 | Spänningsberoende anjon kanal 1 | Mus musculus | 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 12 mg / ml | LDAO | 2,3 | Ujwal et al. 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | 4,2% DMPC, 5% NM | 4 mg / ml | DDM | 1,9 | Luecke et al. 2009 |
| 5 | Romboid proteas | Escherichia coli | 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) | 9 mg / ml | Nonyl glucoside | 1,7 | Vinothkumar, 2011 |
1 rengöringsmedel används för membranprotein rening
2 Native lipider från lila membran kan utföras tillsammans under reningen
Tabell 1. Sammanfattning av kristallisering förutsättningar för strukturer membranprotein lösas med bicelles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bicelles är en unik lipidic medier som erbjuder en infödd tvåskiktsmembran-liknande miljö samtidigt som beter sig som om solubilized av rengöringsmedel. Denna egenskap ger bicelles en klar fördel jämfört med andra lipid-baserade kristallisering metoder eftersom det inte finns någon inlärningskurva eller specialutrustning som krävs för denna teknik. När bicelles finns, antingen kommersiellt eller upprättats i labbet, kan de vara direkt blandas med renat protein och från denna punkt på kristallisering försök gå vidare nästan exakt som med vanliga rengöringsmedel baserade protokoll. Dessutom bicelles erbjuder flera praktiska fördelar jämfört med andra tekniker, bland annat längre lagringstider, enkel integrering av protein, hög genomströmning förmåga med vanliga robotar och rutin visualisering och kristall utvinning. En annan klar fördel är förmågan att knark bicelles med specifika lipider för optimering eller om visat fördel för proteinet av intresse. Sammantaget LipiDIC bicelle metod erbjuder avsevärda mångsidighet i kombination med praktiska enkel användning, vilket gör det lätt godtagbar för alla kristallisering membranprotein projekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. James Bowie och Salem Faham för tillhandahållande av teknisk expertis och vägledning om bicelle metoden och Dr Aviv Paz för användbara diskussioner. Vi erkänner Le Du för experimentellt stöd. Rachna Ujwal har ekonomiskt intresse i MemX biovetenskaper LLC, som dock inte stödja detta arbete. Detta arbete stöddes delvis genom anslag från NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
- Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).
- Nollert, P., Landau, E. M. Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases. Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Faham, S., Bowie, J. U. Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure. J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).
- Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14, 836-840 (2005).
- Luecke, H. Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).
- Ujwal, R. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 Å resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).
- Vinothkumar, K. R. Structure of rhomboid protease in a lipid environment. J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).
- Rasmussen, S. G. F. Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor. Nature. 450, 383-387 (2007).
- Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system. Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).
