Summary
Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
막 단백질 (MPS)는 이러한 모든 세포 organelles 주변 달리 스며들지 막 이중층에 걸쳐 특정 분자를 펌프 등 많은 생리 과정에 중요한 역할을한다. 많은 인간의 질병 및 장애의 의원 결과의 함수에서 변경, 따라서 그들의 구조 복잡한 이해 생물 학적 연구를위한 중요한 목표 남아있다. 그러나, 의원의 구조 결정은 종종 자신의 소수성에서 형태소 분석 중대한 도전 남아있다.
의원은 이중층 내에 포함된 실질적인 소수성 영역을했습니다. 세제는 자주 다음 수용성 단백질과 비슷한 방식으로 조작할 수있는 단백질 세제 마이셀을 생성 이중층에서 이러한 단백질을 solubilize하는 데 사용됩니다. 전통적으로, 결정화 실험은 단백질 세제 혼합물을 사용하여 진행,하지만 그들은 종종 결정에 저항하거나 품질의 크리스털을 생산하고 있습니다. 이러한 문제로 인해 발생하는세제의 무능력이 적절하게 가난한 안정성과 이질에 발생하는 이중층을 모방합니다. 또한, 세제의 보호막은 MP의 소수성 표면은 크리스탈 연락처에 사용할 수있는 면적을 줄일 수. 회피 이러한 단점의 의원이 더 밀접하게 자신의 내생적인 환경을 시뮬레이트 lipidic 미디어에서 크리스털 수 있으며, 최근에는 MP의 결정화에 대한 드 노보 기술되고있다.
Lipidic 입방 위상 (LCP)는 수성 채널 1의 상호 침투 시스템에 의해 3 차원 지질 이중층입니다. monoolein 선택의 지질이지만, 그러한 monopalmitolein 및 monovaccenin 같은 관련 lipids는 또한 LCP 2를 만들기 위해 사용되었습니다. 의원들은 세 차원과 공급 결정 핵의 확산 LCP에 포함됩니다. LCP의 큰 장점은 단백질이 더 네이티브 환경에 남아있다,하지만 방법은 높은 visc 포함한 기술적 단점을 가지고 있습니다osity (전문 apparatuses을 필요로하는)와 크리스탈 시각화 및 조작 3,4의 어려움. 때문에 이러한 기술적인 문제, 우리는 결정 - bicelles 5,6 (그림 1)에 대해 다른 lipidic 매체를 활용. Bicelles는 amphiphile (CHAPSO) 또는 짧은 사슬 지질 (DHPC)와 phosphatidylcholine의 지질 (DMPC)를 혼합하여 형성 지질 / amphiphile 혼합물입니다. amphiphile 분자 선 apolar 가장자리 bilayers와 세제 모두 유익한 속성을 제공함과 동시에 각 bicelle 디스크 내에 지질 분자는 이중층를 생성합니다. 중요한 것은, 그들의 전이 온도 아래 단백질 bicelle의 혼합물은 감소 점도를 가지고 결정화 로봇과 bicelles 호환 만들기, 세제 - solubilized 의원과 비슷한 방식으로 조작됩니다.
Bicelles가 성공적으로 여러 멤브레인 단백질에게 5,7-11 (표 1) 구체화하는 데 사용되었습니다. 이 성장 컬렉션단백질의 prokaryotic과 진핵 소스에서 알파 헬리컬 및 베타 시트 의원 모두 crystallizing에 대한 bicelles의 다재 다능한이 보여줍니다. 때문에 이러한 성공과 높은 처리량 구현의 단순의 bicelles 모든 멤브레인 단백질 crystallographer의 아스날의 일부가되어야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 bicelle 방법을 설명하고 표준 로봇을 사용하여 의원을 정화의 높은 처리량 결정화 실험을 설정하는 데 필요한 단계별 절차를 제공합니다.
Protocol
I) bicelle 형성하는 지질의 준비 : Bicelle 기반 결정은 네 가지 기본 단계 (그림 2)로 구성되어 있습니다, II) bicelle 매체에 단백질을 정제의 결합, 3) 결정화 실험 (수동 또는 robotically) amphiphile 혼합 및 IV) 시각화, 크리스탈 추출 및 냉동. 이 단계는 아래 자세히 설명되어 있습니다
1. Bicelles의 준비
amphiphile 조합 및 농도의 넓은 범위 : Bicelles은 지질의 다양한 형태하실 수 있습니다. 따라서 초기 구성 기반의 이전 성공에 (표 1) 권장 조건은 -입니다. 중 (아래 시약의 표 참조) premixed 즉시 사용 제제와 같은 상업적으로 구입하거나 설명된대로 연구실에 준비할 수 CHAPSO bicelle 제제, : 가장 성공적인 혼합물은 DMPC입니다. 2.8:1 어금니 비율 CHAPSO 혼합물 :이 운동을 위해 우리는 35 % DMPC 1 ML를 준비합니다.
- bicelle 비율과 함께 -40 % 10 % 사이 다를 수 있습니다 DMPC : 2.6-3.0:1 (표 1)에 이르기까지 CHAPSO 어금니 비율.
- 참고 : bicelle 농도가 더 어려워 그것이 높은 솔루션 점도에서 발생하는 지질을 분해하는 것입니다 높은. 그러나, 집중 bicelle 제제는 단백질 농도가 낮은 경우 유리한 수 있습니다.
- 동질적인 솔루션을 얻을 수있는 지질을 용해하는 것이이 단계 bicelle 방법에서 가장 많은 시간 소모하고, 상당한 노력이 필요합니다. DMPC 때까지 다음 단계를 통해 사이클은 완전히 혼합입니다
- 혼합물을 따뜻한 ~ 40 ° C 물 목욕이나 인큐베이터와 ~ 1 분 와동을 사용합니다.
- 참고 : 자세한 사이클이 수행 있기 때문에, 혼합 온난 화의하면 젤 같은 죄수가 발생합니다sistency은 어려운 와동 제공하고 있습니다.
- 몇 분 동안 얼음과 와동에있는 혼합물을 좋았어. 냉각 와동하는 것이 쉽게 솔루션을 녹일 수 있습니다.
- 참고 : 자세한 사이클이 수행되는 바와 같이, 혼합물이 냉각시 뿌옇게 될 수 있습니다.
- 지방질이 완전히 해소되기 전까지 (1.2.1 및 1.2.2) 위에 나열된 단계를 반복합니다.
- 참고 :이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. CHAPSO 배합 : Bicelle 형성은 DMPC의 위상 행동의 변화로 표시됩니다. 완료되면, 혼합은 또는 실온 이상의 맑은 젤 얼음에 점성 액체 것입니다.
- 혼합물을 따뜻한 ~ 40 ° C 물 목욕이나 인큐베이터와 ~ 1 분 와동을 사용합니다.
- bicelle 혼합물은 이제 사용할 준비가되고 장기 저장 (최대 5 년)을 위해 -20 ° C에 보관하실 수 있습니다. 인지질의 머리 그룹의 가수 분해의 위험 때문에, 그것은 오랜 시간 동안 실온에서 bicelles를 저장하는 것이 좋습니다되지 않습니다.
2. bicelles에 단백질의 결합
bicelles에서 얻은 대부분의 MP 구조 DMPC에 크리스털되었습니다 2-8%까지 CHAPSO bicelle의 농도가 8-12 밀리그램 / ML (표 1)의 단백질 농도를 사용합니다. 가능하면, 초기 화면 다음 지침을 사용해야하고 추가 농도는 최적화 단계에서 검사를하실 수 있습니다. LCP 방법에 비해 bicelles와 단백질 설립은 결정화 실험과 같은 날에 이루어져야 간단한 과정을 (그림 3)입니다.
- 맑은 젤로 위상 변화까지 실온에서 CHAPSO bicelle 혼합물 : DMPC를 해동.
- 참고 : 여러 냉동 녹아서은 bicelle 행동에 영향을 미치지 않습니다.
- liquify과 동질적인 bicelle 위상을 다시하기 위해 간략하게 소용돌이에 얼음에 섞어 놓으십시오. 얼음에 배치하면 혼합물은 뿌옇게 될 수 있습니다.
- 프톰이 시점에서 bicelle 혼합을 유지하고 얼음에 단백질 정화. 이것은 pipetting하는 것이 의무가 만드는 액상의 bicelle를 유지합니다.
- 1시 4분 (V / V) 비율 정화 세제 - solubilized 단백질에 bicelle 혼합물을 추가합니다.
- 예를 들면 : 100 μl 단백질 bicelle 혼합 20 μl bicelle와 80 μl 단백질을 혼합하여 얻을 수 있습니다. 단백질 농도가 15 밀리그램 / ML되고 bicelle 농도가 35 % 인 경우,이 12 밀리그램 / ML의 단백질 농도 7 %의 bicelle 농도와 bicelle - 통합 단백질 혼합물을 제공할 것입니다.
- 솔루션은 명확하고 균일한 될 때까지 부드럽게 내용을 pipetting 아래로 섞는다.
- 참고 : 거품이 나타날 경우, 탁상 원심 분리기와 빠른 스핀 (30~60초, 13,000 RPM, 4 ° C)이 그들을 제거할 수 있습니다.
- 단백질 INT의 완전한 결합을 촉진하기 위해 최소 30 분 얼음 혼합물을 품어O bicelles. 단백질 bicelle 혼합물 이제 결정화 실험을위한 준비가되었습니다.
3. 결정화 실험 설정
LCP 같은 다른 지질 결정화 기술은 매체의 높은 점도로 인해 전문적인 장비를 필요로 있지만 bicelles의 독특한 위상 동작은 로봇 (그림 3)를 포함하여 거의 모든 표준 결정화 형식의 구현을 허용합니다. 결정화 실험이 중 표준 상용 스크린을 사용하여 드롭 형식을 걸려거나 앉아 수행하실 수 있습니다.
- 결정화 로봇을 수동으로 트레이를 설정하거나 사용 여부, 얼음 단백질 bicelle 혼합물을 유지합니다. 이것은 단백질 bicelle 혼합물의 추위를 유지하고 솔루션의 점도가 최소 있는지 확인합니다.
- 수동 결정화 실험 - 표준 피펫을 사용하여 단백질 bicelle 혼합물은 일반적으로 수행하는 것과 같은 방식으로 저수지 솔루션으로 혼합 수 있습니다가용성 또는 세제 - solubilized 멤브레인 단백질에 대한 에드.
- 참고 : 실험 기간 동안 얼음에 단백질 bicelle 혼합 보관하십시오.
- 로봇 결정화 평가판 - 우리는 모기 결정화 로봇에 대해 이러한 시련을 맞게 있지만, 원칙적으로 (같은주의 사항 다음과 같은) 기술이 모든 결정화 로봇과 호환되어야합니다. 다음 도움말은 단백질 bicelle 혼합물이 냉각 유지하고 정확하게 로봇 pipetted 확인합니다 :
- Precool 얼음에 배치하여 단백질 bicelle 혼합물을 가진 접시.
- 접시에 단백질 bicelle 혼합물을 피펫과 얼음의 번호판을 계속 진행합니다. 이 플레이트는 실행을 시작하기 전에 로봇에 갈 수있는 마지막 항목한다.
- 모기 로봇의 플랫폼을 각각 3과 5에있는 저수지 트레이 및 결정화 뚜껑, - 설정합니다.
- 플랫폼 4 단백질 bicelle 혼합물을 포함하고있는 접시를 놓고모기 로봇. 이것은 단백질 bicelle 혼합물이 로봇으로 뽑힐 수있는 마지막 보장하고 즉시 공개합니다.
- 가열 및 증가 점도를 방지하기 위해 단백질 bicelle 혼합물로 저수지를 혼합하지 않습니다.
- 여러 개의 스크린을 수행하면 바로 실행이 완료되면 즉시 냉각 얼음 bicelle 단백질 플레이트를 반환합니다.
- 드롭 볼륨과 비율 (단백질 : 저수지)는 종래의 결정화 실험에 관해서는 선택할 수 있습니다. bicelle 혼합 플러스 0.25 μl 저수지 : 예를 들어, 모기 로봇을 사용하여 초기 결정 실험은 0.25 μl 단백질을 사용하여 설정할 수 있습니다.
- 20 챔버에있는 크리스탈 시련을 품어 ° C. bicelles의 위상 문제가 온도에 의존하기 때문에 온도가 좋은 심사 및 최적화 매개 변수입니다.
- 높은 기온은 사전 구성의 이점을 가진 층상 단계 12 (그림 1), 유도레이어에있는 단백질. 20 ° C 이하의 온도가 상영 될 수 있지만,이 이후 C는 장시간 동안 침전에 lipids의 원인이 될 수 있습니다 ° 당신이 네 아래에 가지 말았어야 해.
- 전통적인 결정화 실험과 동일한 방법으로 bicelle 재판은 결정 모양과 성장을 정기적으로 모니터링해야합니다. 우리는 1 일 및 3 층 일 후 설치를 매주 검사 다음에 쟁반을 확인하는 것이 좋습니다.
- 크리스탈 최적화는 정기적으로 그리드 심사, 첨가제 심사, 또한 온도 등을 변경 bicelle 비율과 단백질을 포함한 세제 기반의 결정에 사용된 방법을 사용하여 수행하실 수 있습니다 bicelle 비율은 다양 수 있습니다. 또한, bicelles은 단백질의 안정성이나 기능을 위해 필요할 수 있습니다 특정 lipids로 도핑된 수 있습니다.
4. 시각화, 크리스탈 추출 및 냉동
단백질 bicelle 혼합물로 결정 재판 이후 단백질 세제 방울, 시각화 및 수정 추출과 비슷한 점도가 일상이고 전통적인 세트 업과 같은 수행됩니다했습니다.
- 시각화 : 크리스탈 자주 감지 정상과 편광에 따라 고품질의 조명을 필요로 LCP 미디어에 대조적으로, 시각화가 bicelles에 의해 방해하지 않습니다. 컬러뿐만 아니라 무색 단백질 크리스탈 방울 쉽게 표준 현미경과 특별한 장비가 필요하지 않습니다를 사용하여 분석하실 수 있습니다.
- Bicelles은 다른 lipidic 미디어처럼, 잘못된 반응의 높은 비율을 생산하는 경향이 있습니다. 자외선 현미경은 크게 소금 결정 (그림 4)에서 단백질을 구별에 도움이됩니다.
- 추출 및 냉동 : 크리스탈 추출 및 냉동이 비교적 간단하고 주변 bicelle 미디어의 해산을 요구하지 않습니다. 또한, bicelle 단계 자체는 일부 중간 cryo - 보호 기능을 제공합니다.
5. 대표 결과 :
NT "> 그것은 일반적으로 표시하고 자신의 최대 크기로 성장할 수 있도록 약 일주일 이상 결정 2-3 일 소요됩니다.이 bacteriorhodopsin 마우스 전압 - 의존 음이온 채널 1 (mVDAC1) 크리스탈 4,8의 경우했습니다 . 다른 멤브레인 단백질에 대한 그것은 크리스탈 성장을위한 몇 주가 걸릴 수 있으니 잘 첫 주 이상의 수정 시도를 계속 모니터링하는 것이 중요합니다.다른 lipidic 미디어와 마찬가지로 bicelles가 결정 것으로 나타날 수 있습니다 형태를 형성하는 경향이 있습니다. 그것은 또한 소금과 세제 결정의 높은 비율로 이어질 것이 관찰되었습니다. 트립토판 형광을 감지 UV - 현미경 상당히 등 비 proteinaceous 잘못된 반응을 제거할 수 있습니다. 그림 4로 관찰 될 수있는 다른 결과를 구별할 수 있도록 표시하고 자외선에 많이 본 지질 형태, 소금과 단백질 결정을 보여줍니다.
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그림 1. Bicelle 도식. Bicelles 그러한 DMPC (파란색)과 같은 이중층의 소수성 가장자리를 보호 CHAPSO (녹색)로 amphiphile로 이중층 형성 지질 분자로 구성되어 있습니다. 온도가 증가되기 때문에, 디스크 같은 bicelles은 천공 층상 시트 12에 위상 변화를 받고있다.
그림 2. 네 가지 기본 단계를 개요 bicelle 결정화 방법 흐름도.
그림 3. 크리스탈 재판이 설정 설계도. 정화 세제 것은 - solubilized 막 단백질 직접 간단하게 함께 내용을 pipetting하여 얼음 bicelles와 혼합 수 있습니다. ~ 30 분, 결정화 실험을 위해 얼음에 단백질 / bicelle 혼합 잠복기 후로봇을 포함한 모든 표준 형식을 사용하여 설정할 수 있습니다.
그림 4. 크리스털 재판의 시각화. 소금 전용 상태로 관찰 (A) 바늘 모양 결정의 보이는 이미지 (맨 위 패널)와 UV 이미지 (하단 패널). 없음 형광는 크리스털의 허위 긍정의 표시를 감지 수 없습니다. (B)로드 모양의 크리스탈이 MPD 상태 형성. 크리스탈은 약하게 fluoresced하지만 X - 선 회절을 사용하여 비 proteinaceous 것으로 발견되었습니다. (C) 크리스탈에 대해 사주 시련을 설정 후 관찰했다. 자외선 아래에서 강한 형광은 단백질 크리스탈 확인합니다.
| 번호 | 단백질 | 출처 | Bicelle 제제 | Concentrati 단백질에 | 세제 1 | 해상도 (A) | 참고 |
| 일 | Bacteriorhodopsin이 | Halobacterium salinarum | 8퍼센트 DMPC : CHAPSO (2.8:1) | 8 MG / ML | 2.0 | Faham과 보위, 2002 | |
| 8퍼센트 DTPC : CHAPSO (3시 1분) | 8 MG / ML | 1.8 | Faham 외., 2005 | ||||
| 이 | β2 - 아드레날린 수용체 / 팹 복합 | 호모 사피엔스 | 8.3 % DMPC : CHAPSO (3시 1분) | 10 MG / ML | DDM | 3.4/3.7 | 라스무센 외., 2007 |
| 3 | 전압 - 의존 음이온 채널 1 | 뮤스의 musculus | 7% DMPC : CHAPSO (2.8:1) | 12 MG / ML | LDAO | 2.3 | Ujwal 외., 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | 4.2 % DMPC, 5 % NM | 4 MG / ML | DDM | 1.9 | Luecke 외., 2009 |
| 5 | 장사 방형 프로 테아제 | 대장균 | 2퍼센트 DMPC : CHAPSO (2.6:1) | 9 MG / ML | Nonyl glucoside | 1.7 | Vinothkumar 2011 년 |
막 단백질 정화에 사용 한 세제
보라색 점막에서 2 기본 lipids는 정화 동안 함께 진행 될 수 있습니다
표 1. 막 단백질 구조의 결정화 조건을 요약 bicelles를 사용하여 해결.
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Discussion
Bicelles는 세제로 solubilized 것처럼 행동하면서 기본 이중층 같은 환경을 제공하는 독특한 lipidic 미디어입니다. 어떤 학습 곡선 또는이 기법에 필요한 전문 장비가 없기 때문에이 속성은 bicelles에게 다른 지질 기반 결정화 방법에 비해 뚜렷한 장점을 제공합니다. 일단 bicelles가 상업적 또는 실험실에서 준비 중 사용할 수있는, 그들은 결정화 실험은 거의 정확하게 표준 세제 기반 프로토콜과 수행에 단백질을 정제와이 시점에서 직접 혼합 수 있습니다. 또한, bicelles는 표준 로봇과 일상적인 시각화와 크리스탈 추출을 사용하여 확장 저장 기간, 단백질의 단순한 결합, 높은 처리량 기능을 포함한 다른 기술에 비해 몇 가지 실용적인 장점을 제공합니다. 또 다른 독특한 장점은 최적화를위한 구체적인 lipids와 마약 bicelles 수있는 능력하거나 관심의 단백질에 대한 유익 표시하는 경우. 합쳐 놓으면, lipiDIC bicelle 방법은 모든 멤브레인 단백질 결정화 프로젝트를 위해 쉽게 adoptable 만들기, 실질적인 용이성의 사용과 함께 상당한 다기능을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs를 감사하고 싶습니다. bicelle 방법과 유용한 토론 박사 Aviv 파스에 대한 기술 전문 지식과지도를 제공하는 제임스 보위와 살렘 Faham. 우리는 실험 지원 르 뒤를 인정합니다. Rachna Ujwal 그러나이 작품을 지원하지 않았 MemX Biosciences LLC에서 금융 관심이 있습니다. 이 작품은 NIH (RO1 GM078844)에서 부여에 의해 일부 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
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