Summary
脱壳是在HIV - 1生命周期的早期阶段的重要一步，并定义为衣壳外壳的拆卸和释放病毒核蛋白复合物（vRNP）。在这里，我们展示了隔离HIV - 1病毒颗粒的完整的核心和量化其脱壳技术
Abstract
的逆转录病毒的基因组是由脂质包膜包围一个衣壳，包裹。慢病毒，如HIV - 1，锥形衣壳外壳组成的六角晶格排列的CA蛋白。衣壳是关闭的7 pentamers广泛年底，在窄的一端的锥1，2 5。在这衣壳外壳外壳是病毒的核蛋白复杂，和他们一起组成的核心。
HIV - 1病毒膜与靶细胞膜的融合，是释放到细胞质。衣壳，然后拆卸 3中的可溶性形式释放游离Ca简称为脱壳的过程。细胞内的位置和HIV - 1脱壳的时间是知之甚少。在CA的单一氨基酸替换改变衣壳的稳定性也削弱的HIV - 1感染细胞的能力4。这表明衣壳的稳定性是HIV - 1感染的关键。 HIV - 1脱壳已经很难研究由于缺乏这个过程中的敏感和可靠的检测。在这里，我们描述了一个定量方法研究使用体外传染性的HIV - 1颗粒分离的核心脱壳。该方法涉及了一层洗涤剂，并通过集中的病毒颗粒的沉淀核心的隔离成线性蔗糖梯度，在寒冷的。要量化脱壳，孤立的核心是在37 ° C的各种时间间隔，随后离心沉淀。脱壳程度上清液中的CA的一小部分通过量化分析。已采用这种方法分析HIV - 1衣壳的稳定性4，5，6的病毒突变的影响。研究HIV - 1脱壳的细胞因子的作用，还应该有用。
Protocol
1。生产的HIV - 1颗粒
在继续之前，必须获得许可，并按照您的机构的生物安全办公室的工作在艾滋病毒传染性批准了一项生物安全设施的指引。您必须确保适当的照顾，并在生物安全实验室工作期间的安全防范措施。
HIV - 1颗粒的生产通常是由瞬时转染293T细胞与HIV - 1前病毒DNA使用一个磷酸钙转染方法7，8 。也适用于高滴度病毒感染T细胞的文化成长股票。
- 文化293T细胞贝科的修改鹰中等（DMEM）中含有10％胎牛血清（FBS），并用抗生素为辅[青霉素（100国际单位/毫升）和链霉素（100微克/毫升）]在37 °彗星，5％的CO 2 。
- 从近融合的菜肴分离细胞，用0.25％胰蛋白酶- EDTA和种子 2X10 6
- 第二天，细胞单层应该是25％左右相连，并准备转染。 6转染细胞的菜肴，带来120微克的前病毒DNA 2.7毫升无菌水的体积。这种混合物添加0.3毫升2.5米氯化钙2和3毫升2XBBS，混合移液器上下几次正确。让混合物在室温下静置10-20分钟。
- 加入1毫升的混合物滴加，每道菜的中心，而纷飞轻轻混合。放置在一个孵化器设定在35 ° C和3％的CO 2的菜过夜（〜16小时）。
- 吸出培养基，轻轻地添加5毫升PBS。
- 吸PBS和添加5毫升新鲜培养基。文化的细胞培养箱中培养37及度; C和5％CO 2额外的24-48小时。
- 收集含有病毒颗粒的培养上清，转移至50 ml离心管。从所有菜肴相结合的上清，离心5分钟沉淀细胞和碎片在1500 XG。使用0.45微米孔径的针头式过滤器，过滤上清液。应采取的预防措施，以尽量减少气溶胶的形成，而与活病毒的工作。这包括使用锥形管，用O型环，或在转子水桶盖的离心步骤。如果这是不可能的，管的螺丝帽应包装封口膜。
2。浓度的HIV - 1病毒颗粒通过超速离心
- 放置在一个38.5毫升polyallomer的离心管（贝克曼SW32Ti转子或同等学历）的培养上清（30毫升）。轻轻衬底5毫升20％的PBS中，用5毫升吸管蔗糖溶液含有病毒上清。
- 3小时离心32000 RPM在4 ° C（175,000 r 最高 XG）沉淀病毒颗粒。
- 取出吸上清，照顾不打扰沉淀在试管底部。加入0.5毫升1XSTE缓冲区（10毫米的Tris - HCl [pH值7.4，100 mM氯化钠，1 mM EDTA的）管的地方，并在4 ° C为1小时放松沉淀。使用一个大口径的1毫升吸管尖轻轻吸管上下几次从管底沉淀分离。接下来，转让松动颗粒到1.5 ml离心管，照顾，以避免起泡。孵育另一个1-3个小时，让病毒的小团块分散在4 ° C。在此期间，准备在步骤3.1中所述的蔗糖梯度。
- 轻轻地将吸管上下数次，并在8000转（6000 XG）在4℃冷藏在1分钟离心彗星离心机的病毒悬液，以去除残留的团块。在此过程中保持样品冷。
3。蔗糖梯度离心隔离内核
HIV - 1核心是孤立的“自旋式”方法9，这是修改先前所描述的方法纯化HIV - 2 核心 10 。
- 准备14.5毫升polyallomer SW32.1Ti转子的离心管12毫升1XSTE缓冲区的线性30％至70％蔗糖密度梯度。要做好准备梯度，使用前20毫升的梯度;附近放置6毫升70％的蔗糖溶液（靠近出气口）和远方30％的蔗糖溶液6毫升。确保气泡没有被困在通道连接两院。使用前从底部到顶部包含底部85％的蔗糖溶液1毫升的管泵的梯度自动Densi流梯度。梯度轻轻将在4 ° C，直到冷却（2-4小时）。
- 使用一个大口径的1毫升吸管尖轻轻地覆盖在科技教育的梯度含有1％的Triton X - 100的0.25毫升15％的蔗糖溶液。 轻轻覆盖，用0.25毫升7.5％蔗糖科技教育，用一个大口径的1毫升吸管尖端的解决方案。一定要小心，不要混合层。
- 从步骤2.4与0.5毫升病毒悬液轻轻叠加。这一步应该认真执行，以避免在渐变中的任何干扰和混合underlaid蔗糖层。
- 管放置在预冷SW32.1Ti桶和离心32,000 RPM（r 最高 XG 187000）过夜（16-20小时）在4 ° C。为了避免暂停离心机，不启动离心真空离心机，直到达到250微米
- 收集1毫升分数从顶部底部使用自动Densi流量梯度分馏梯度。管收集后立即置于冰上。反相几次混合管的内容，并撤回50μL每个ELISA或逆转录酶活性检测的量化分数。
4。 HIV - 1核心的本地化和存储的核心
- 执行脱壳分析之前，重要的是要确定哪些分数包含完整的HIV - 1核心。这可以由P24 ELISA或逆转录酶的活性测定步骤3.6使用50μL等份。
- 与核相关的CA的复苏往往涉及到稳定的核心。 9 P24 ELISA法使用样品从每一个分数衡量的核心相关的CA 。另外，衡量每个分数的逆转录酶活性。使用这两种方法的峰值应该围绕分数10。
- 池的分数包含核心。如果不脱壳立即检测，到0.2至0.3毫升分装，液氮和存储的闪存冻结在-80 ° C等分汇集核心的核心是以这种方式冻结的核心是适合脱壳检测。核心相关的CA的收益率通常是1-2微克每毫升P24或约15％的总的病毒粒子相关P24。
5。 HIV - 1脱壳动力学检测
- 每脱壳反应所需的HIV - 1核心的金额约为50纳克。要执行在体外脱壳检测，predilute核心等分等体积冷1XSTE缓冲区，以减少悬浮液的粘度，并尽量减少移液错误。
- 进一步稀释到0.15毫升1.5毫升的离心管中含有10微克/ ml的BSA的缓冲冷1XSTE 100μL的核心。我们补充与牛血清白蛋白（10微克/毫升）的STE缓冲，以尽量减少CA的吸附管的墙壁。混合反相管的几倍。不要涡旋样品。水浴管在37 ° C的时间间隔（15，30，60和120分钟）。管应沉浸在水浴中至少内部采样水平，以确保即使变暖。
- 孵化过程中，轻轻混匀管的内容定期（一般为5 -10分钟）弹管。对于零分钟控制，稀释成0.15毫升冷1XSTE缓冲液100μL的核心，并在冰上孵育实验（120分钟）的整个长度。零分钟控制提供了基础脱壳值，用于确定在37 ° C下孵育不同的时间间隔的核心脱壳增加。
- 在潜伏期结束，停止脱壳过程中，在冰中放置10分钟的管。
- 离心管，45,000 RPM（TLA - 55转子; 125,000 r最高XG）20分钟，在4 ° C 。这将颗粒完整的核心和自由为核心脱壳的CA发布将继续留在上清。预冷的转子应在4 ° C之前加载样品。
- 将上清转移至新预冷的离心管，最好使用在室温下储存的凝胶加载提示。请注意，颗粒将肉眼不可见，所以采取极端的照顾瓦特hile吹打出上清液。 ELISA样品稀释液250μL（0.5％的Triton X - 100和5％的捐助者的小牛血清的PBS）重悬的颗粒。为了确保颗粒溶解后加入ELISA样品稀释液的高效，涡。使用P24 ELISA法如以下部分所述，量化的沉淀和上清的CA内容。
- 脱壳程度获得通过计算上清液中的CA的一小部分。
6。为CA P24酶联免疫吸附测定
- 许多商业ELISA试剂盒，可用于量化CA。使用任何商业或“内部”ELISA法，包括P24的标准来确定检测的线性。稀释的样品应当检测，以确保准确性。
- 我们已经开发出一个自制的ELISA我们经常使用的CA检测。的过程，是适应从以前的报告第11和使用捕获和检测抗体可从NIH援助的研究和参考试剂的计划。
7。代表性的成果：
从ELISA结果确定分数包含核心的一个例子是如图1所示。后收集的分数（每1 mL），50μL的样品从每个分数是用来做系列稀释，并用ELISA分析。 P24增加12分数值总额为14.5微克。正如图中的分数显示8日至10所载的核心。 P24价值为核心含分数为2.17微克。核心相关的P24的比例（14.97％）是由P24价值的核心成分的比例（2.17微克）的P24值总额（14.5微克）。分数1或2将始终包含最高的P24数额;这免费的CA，这是不符合相关的核心。其次是每个后续的分数与P24值逐渐减少，然后急剧增加，终于在锐减的P24值。如果采取适当的照顾，同时加载的梯度，然后核心相关的CA峰附近发现的一小部分10。
化验HIV - 1芯脱壳动力学得到一个典型的结果如图2所示。图表显示在野生型HIV - 1核心脱壳的时间依赖性增加。 ％脱壳值计算上清液中的CA的一小部分。通过练习，检测是高度重复性，并确定在体外的病毒核心的稳定非常有用。请注意，检测的可重复性是高度依赖的样品在操作过程中妥善处理。由于内核是热不稳定，样品应保持在4 ° C整个检测，除在潜伏期。
图1平衡密度梯度离心HIV - 1核心。浓缩病毒悬液被应用到了30％至70％的线性蔗糖梯度覆盖1％TRITON - X - 100的顶部。以下过夜离心187000 XG和4 ° C，1毫升的分数（分数1）从顶部的底部（分数12）收集和P24用ELISA量化。
图2 在体外对HIV - 1脱壳的时间当然。纯化的HIV - 1核心是稀释和培养在37℃，在指定的时间间隔。零分钟样品孵育实验的整个长度的冰。经过孵化，20分钟样品ultracentrifuged 125000 XG在4 ° C。上清和沉淀分离和P24酶联免疫吸附分析。脱壳程度被认定为在协议文本描述。每个脱壳反应是一式两份;误差线跨越两个值的范围。
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Discussion
这里描述的方法来净化HIV - 1核心，研究在体外脱壳研究这种HIV - 1生命周期的阶段，特别是由于没有一个有效的方法来分析靶细胞的HIV - 1脱壳。虽然这种方法使用平衡离心净化核心，其他人使用简要裂解后直接制粒，1％的Triton - X - 100 12 13或通过造粒蔗糖垫覆盖0.1％的Triton X - 100 的14，15 。
通过这种方法获得的内核的复苏是受实验误差。一个变量是在这个协议的成功转染效率。通常情况下，我们加载的病毒数量相当于至少7微克P24梯度。我们的实验室使用磷酸钙转染了病毒的生产方法。虽然其他转染方法，也可能是合适的，我们还没有评估为核心的隔离他们。其他重要的VARiables影响核心的产量是在应用层的梯度和样品冷采取的护理。准备的蔗糖梯度，以避免梯度混合时，必须采取极为谨慎。任何干扰，同时运用集中的病毒悬液，可能会导致不受欢迎和早期接触与下方的阻隔蔗糖层的清洁剂，病毒粒子，这种长期接触可能掰开脆弱的核心，导致减少衣壳协会。这也是同样重要的是保持整个过程中的蔗糖密度梯度和病毒悬液冷。程序已经掌握并成功地应用于许多不同领域的科学家，在我们的实验室。
HIV - 1核心耐热，因此，它是非常重要的分馏蔗糖梯度，而它是冷的，并立即置于冰上收集馏分。由于核心的脱壳也依赖于pH值和盐分浓度的缓冲4，这是非常可取的STE缓冲的pH值来衡量，然后再进行检测。脱壳率可能会略有不同，每批核心。脱壳反应，应一式两份，如果值超过15％的不同的反应，那么应该是一式三份进行，直到达到一致性。游离钙蛋白有一种倾向，坚持管内壁;，因此它必须包括一个反应混合物中的终浓度为10微克/毫升，以尽量减少CA的吸附管的墙壁BSA。
如前所述，这里描述可用于识别和研究细胞因子的影响脱壳脱壳检测。它也可以用来研究衣壳的目标化合物，并使用一种内源性逆转录试验的核心逆转录细胞因子的影响。足够数量的HIV - 1核心的隔离还可以允许分析与细胞因子的免疫电子显微镜衣壳的相互作用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
HIV - 1脱壳在艾肯实验室的研究是由NIH的拨款AI40364，AI50423和AI076121支持。几个关键材料，包括在P24 ELISA试剂，由美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考程序，艾滋病司，NIAID的，国立卫生研究院提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
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