Summary
리프트 밸리 열병 바이러스 MP - 12 백신 스트레인에 대한 역방향 유전 시스템은 증가 감쇄 및 immunogenicity로 추가 MP - 12 돌연변를 만들기위한 유용한 도구입니다. 우리는 NSS 돌연변이 변종을 생성하고 특성화 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
출혈성 발열, 신경 장애 또는 인간의 실명 및 고속 낙태와 ruminants 1 태아의보기 흉한 것의 원인이 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)는, 선택한 에이전트 및 위험 그룹 3 병원체를 중복 HHS / USDA으로 분류되었습니다. 그것은 가족 Bunyaviridae에 속 Phlebovirus에 속한이 가족의 가장 악성 멤버 중 하나입니다. RVFV MP - 12 백신 스트레인 2,3뿐만 아니라 ZH548 및 ZH501를 포함한 야생 형 RVFV의 변종 4-6에 대한 몇 가지 역방향 유전 시스템은 2006 년부터 개발되었습니다. MP - 12 변형은 (위험 그룹 2 병원체가 아닌 선택 대리인되는) 몇몇은의 돌연변이 M과 L - 세그먼트로 높은 감쇠 있지만, 여전히 기능 독기를 인코딩 악성 S - 세그먼트 RNA 3, 운반 요소, NSS. 그것으로 effic 복제하면서 rMP12 - C13type (C13type)는 NSS ORF의 삭제 - 프레임의 69 % 나르는 것은, 모든 알려진 NSS 기능을 결여ient는 VeroE6 세포의 MP - 12 타입 - I IFN에 부족 않습니다. NSS는 인터페론 (IFN) - 베타 mRNA 7,8를 포함하여 호스트 전사의 종료 - 오프를 유도하고 사후 translational 수준에서 두 번 좌초 RNA - 의존 단백질 키나제 (PKR)의 저하를 추진하고 있습니다. 9,10 IFN - 베타 transcriptionally입니다 인터페론 규제 요인 3 (IRF - 3), NF - KB 및 활성 단백질 1 (AP - 1) 및 IFN-alpha/beta 수용체에 IFN - 베타의 바인딩 (IFNAR)에 의해 upregulated는 IFN - 알파의 전사를 촉진 NSS에 의한 IFN - 베타 유전자를 포함하여 호스트 전사 억제 바이러스는 복제에 대한 응답으로 그 ISGs의 유전자 upregulations을 방지 반면, 호스트 항바이러스 활동을 유도 유전자 또는 다른 인터페론 자극 유전자 (ISGs) 11, 비록 IRF - 3, NF - KB와 활성제 단백질 1 (AP - 1) RVFV7에 의해 활성화될 수 있습니다. . 따라서, NSS 추가 MP - 12을 자제하고, IFN - 베타 억제 기능을 폐지하여 호스트 타고난 면역 반응을 향상시킬 수있는 좋은 대상입니다. 여기에우리는 재조합 MP - 12 인코딩 변이된 NSS 창출을위한 프로토콜을 설명하고, IFN - 베타 mRNA 합성을 억제하는 기능을 부족한 NSS 돌연변이를 확인하기 위해 검사 방법의 예를 제공합니다. 타고난 면역에 그 본질적인 역할뿐만 아니라, 입력 - I IFN이 돌기 세포 및 적응 면역 반응의 유도 12-14의 성숙을 위해 중요합니다. 따라서, NSS의 돌연변이 타입 - I IFN을 유도하는 것이 더 감쇠 있지만, 동시에 접종 방식에 적합하게 후보자 야생 형 MP - 12보다 자극 호스트 면역 반응에 더 효율적입니다.
Protocol
1. 플라스미드 DNAs 2 재조합 MP - 12 인코딩 NSS 변이 (들)의 복구
- 보급 아기 햄스터 신장 (BHK) / T7 - 9 세포 15, 안정적으로 표현 T7 RNA 효소, 최소 필수 매체 6 cm 요리로 (가상) 알파 10% 태아 소 혈청 (FBS를 포함하는 (Invitrogen, 고양이 # 32561037) ), 페니실린 - 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML) (Invitrogen, 고양이 # 15140122), 600 μg / hygromycin B의 ML (Cellgro, 고양이 # 30-240 - CR).
* 바이러스 복구의 효율은 35 mm 요리보다 6 cm의 요리 높다. 낮은 통로 수준 BHK/T7-9 세포는 회복의 높은 속도를 지원합니다. 또는 다른 BHK 세포 라인 안정 표현 T7 RNA 효소는 4,5,16,17를 사용할 수있다. - 세포 confluency 70~80%에 도달하면 신선한 10% FBS 및 스트렙토 마이신 페니실린 -을 (hygromycin B를 포함하지 않는)가 포함된 가상 - 알파. 문화 뜨는 교체
* 세포 transfecte해야D T7 RNA 중합 효소의 표현의 손실을 피하기 위해 매체를 교체 후 1 시간 이내. - RVFV, 전체 길이 바이러스성 RNA 표현에 대한 바이러스 게놈 RNAs를 인코딩 plasmids 세트의 복구 및 바이러스 단백질 표현 (그림 1 및 2) 바이러스성 유전자 열린 독서 프레임을 인코딩 두 번째 집합에 대한 필요합니다. 1.5 ML 튜브에 다음 plasmids2 (그림 2)의 혼합물을 준비 :
- NSS 유전자 (2 MG)에 돌연변이 (들)과 pProT7 - S는 (+) :이 플라스미드는 안티 바이러스 - 감각 (긍정적 의미)를 인코딩 장편 RVFV MP - 12와 T7 프로 모터 둘러싸인 S - 세그먼트 A 형 간염 델타 바이러스 (HDV) ribozyme 시퀀스.
- pProT7 - M (+) (2 MG).이 플라스미드는 안티 바이러스 - 감각 (긍정적 의미) 전체 길이 RVFV MP - 12 T7 프로 모터 및 HDV ribozyme 순서 둘러싸인 M - 세그먼트를 인코딩
- pProT7 - L (+) (2 MG)가 :이 플라스미드는 안티 - 바이러스 - 감각을 인코딩 (긍정적 의미) 전체 길이 RVFV MP - 12 L - 세그먼트 FLAT7 프로 모터 및 HDV ribozyme 순서에 의해 nked.
- pT7 - IRES - VN (2 MG) :이 플라스미드는 RVFV MP - 12 N 열 독서 프레임 (ORF) T7 프로 모터 및 encephalomyocarditis 바이러스 (EMCV) 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)의 스트림을 인코딩합니다.
- pT7 - IRES - VL (1 MG) :이 플라스미드는 인코딩 RVFV MP - 12 L ORF T7 프로 모터 및 EMCV IRES의 하류.
- pCAGGS - VG (1 MG) :이 플라스미드는 닭고기 베타 굴지 모터의 RVFV MP - 12 M ORF의 하류를 인코딩합니다.
* pT7 - IRES - VN, pT7 - IRES - VL과 pCAGGS - VG의 추가는 MP - 12의 복구에 필수적인 것은 아니지만 그것은 구조 2의 효율성을 향상시킵니다. 저자 플라스미드, 아마도으로 인해 변이에 의해 AUGs의 누설 검사의 부족으로 pT7 - IRES를 사용하여 GN / GC의 가난한 표현을 경험. 따라서, 우리는 캡 - 의존 GN / GC 표현 pCAGGS - VG를 잽니다.
- Opti - 가상의 385 ML (Invitroge로 중계 - LT1 30 ML (Mirus, 고양이 # MIR2300)를 추가N, 고양이 # 1.5 ML 튜브 31985070) 및 와류 짧게.
- 상온에서 5 분 부화 후, 천천히 pipetting하여 부드럽게 혼합하여 실온에서 15 분 부화 단계 1.3에서 플라스미드 혼합물에 liposomes가 포함된 Opti - 가상을 추가합니다.
- 드롭하여 단계 1.2 드롭 (그림 3)에서 BHK/T7-9 세포의 문화 매체 리포좀과 plasmids의 혼합물을 추가하십시오.
- 24 H에 대한 5 % CO 2 배양기에서 37 transfected 세포 ° C를 부화하고, 함께 문화 뜨는을 대체할 새로운 10% FBS 및 페니실린 - 스트렙토 마이신을 (hygromycin B를 포함하지 않는)가 포함된 가상 - 알파.
- 37 세포를 품어 ° C 배양기에서 4 추가 일 (총 5 일째 부화), 그리고 15 ML 관에 문화 supernatants를 수집을위한 5 % CO 2.
* cytopathic 효과 (CPE)이 여기에 관찰이 반드시 성공 바이러스 복구의 결과를 반영하지 않기 때문에 transfection바이러스성 RNA 복제 또는 바이러스성 단백질 합성에 의한 CPE과 유사하게 나타납니다 세포 죽음을 유도. - ° C 5 분 4 2,200 XG에서 supernatants을 원심.
*이 단계의 목적은 바이러스 주식에서 세포 파편 다운 펠렛하는 것입니다. 에어로졸 - 꽉 원심 분리기의 버킷은 증가 안전을 위해 권장합니다. - 나사 캡 5 ML의 cryotubes에 supernatants를 전송하고, 통로에게 ° C 이상 사용을위한 -80에서 0 (P0) 바이러스 주식을 저장합니다.
2. P0 바이러스의 증폭
- P0 샘플은 종종 하류 실험 2에 대한 충분한 바이러스 titer가 포함되어 있습니다. IFN-alpha/beta의 유전자에게 18,19 부족한 아프리카 녹색 원숭이 신장 (Vero) 세포의 클론입니다 VeroE6 세포의 증폭 단계, 최대 수준으로 바이러스 titer를 증가시킵니다. 또는, 다른 세포는 IFNAR1 - 녹아웃 마우스 21 migh에서 같은 Hec1B 세포 20 MEF 세포와 같은 타입 - I IFN 응답 부족t는이 단계에 사용합니다. 10% FBS를 포함하는 Dulbecco의 수정 최소 필수 배지 (DMEM) (Invitrogen, 고양이 # 11965092)에서 10 cm 요리에 VeroE6 세포를 확산 페니실린 - 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 밀리그램 / ML) 및 부화 37 ° C 배양기에서 5 % CO 2와 함께 그들이 80 % confluency에 도달할 때까지.
돌연변이 NSS를 인코딩 * 재조합 MP - 12 계통은 종종 타입 - 나 IFN - 유능한 세포에 효율적으로 복제 실패합니다. - 10% FBS 및 스트렙토 마이신과 페니실린 - DMEM의 2.7 ML과 P0 300 ML 시료를 섞습니다. 단계 2.1에서 VeroE6 세포에서 배지를 제거하고 희석 P0 샘플로 바꿉니다. ° C가 인큐베이터 1 H에 대한 5 % CO 2와 37 알을 품다.
- inocula를 제거하고 각 요리 10 % FBS 및 스트렙토 마이신과 페니실린 - DMEM 10 ML를 추가합니다.
- 37 품어 ° C VeroE6 세포의 CPE는 명백한 될 때까지 3~4일하십시오.
monolayer의 * 장애는 MP - 12 감염, whil 동안 발생이러한 rMP12 - C13type (C13type) (그림 4)와 같은 전자 재조합 MP - 12 부족 NSS는 monolayer를 방해하지 않지만, 죽은 떠있는 세포의 숫자가 2-3일 감염 후 나타납니다. - 같은 섹션 1.9) 및 1.10에서 설명한 3-4 DPI에서 뜨는을) 수확 및 E6P1로 샘플을 지정합니다.
3. 플라크 분석하여 재조합 MP - 12의 적정
- 6 - 잘 접시에 VeroE6 세포를 확산.
샘플 당 * 중복 분석은 단일 분석보다 더 신뢰할 수있다. - 다음과 같이 VeroE6 세포 confluency 80 % 성장 경우 10-6까지 10% FBS 및 스트렙토 마이신과 페니실린 - DMEM에서 바이러스 샘플의 10 배 시리얼 dilutions 준비 :
- E6P1 샘플 중 10 μl + 10% FBS 및 스트렙토 마이신과 페니실린 - DMEM의 990 ML (10 -2 희석)
- 10 -2 샘플 100 μl + 10% FBS 및 스트렙토 마이신 페니실린 - (10 -3 희석)와 DMEM 900 ML
- 10010 -3 샘플 + 10% FBS 및 스트렙토 마이신 페니실린 - (10 -4 희석)와 DMEM 900 ML의 μl
- 10 -4 시료 100 μl + 10% FBS 및 스트렙토 마이신과 페니실린 - DMEM 900 ML (10-5 희석)
- 단계 3.1에서 6 잘 접시에서 매체를 기음과 우물 (그림 3)에 각 희석 400 μl를 (단계 3.2에서) 추가합니다.
- ° C가 인큐베이터 1 H에 대한 5 % CO 2와 37 알을 품다.
- 부화 기간 동안 다음과 같이 한천 - 오버레이 두 15 ML 튜브를 준비 :
튜브 (42 ° C 물 목욕을 유지) : 물 속에 1.2 % 귀족 한천 7 ML (VWR, 고양이 # 101170-362)
튜브 B (37 ° C 물 목욕에 보관) : 수정된 이글 중간 7 ML (가상 2X) (Invitrogen, 고양이 # 11935046) 10 % FBS를 포함하는 페니실린 - 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML)와 10 %의 Tryptose 인산 국물 (MP의 biomedicals, 고양이 # 1682149). - 1 H 보육 후, 바이러스를 제거inocula하고, 즉시이 ML 당 우물의 튜브와 튜브 B (3.5 단계에서)의 1:1 혼합물을 추가합니다.
* 감염되지 않은 세포의 죽음의 원인이 우물 최대 건조 등 즉시 오버레이를 추가할 수 조심. - 5% CO 2 배양기에서 3 일간 37 ° C에서 접시를 품어.
- 준비 관하고 다시 같은 단계 3.5에 설명된 튜브 B. 또한, 또한 37 ° C 물 목욕에 보관 판 당 0.33 % 중성 빨간색 솔루션 (시그마 알드리치, 고양이 # N2889 - 100ML) 500 μl를 준비합니다.
- 믹스 튜브, 튜브 B 및 중립 붉은 솔루션 500 ML (마지막 conc. 0.011 %)과 잘 혼합 당 2 ML를 추가합니다.
* 추가 될 중립 붉은 솔루션의 금액은 중립 붉은 솔루션의 많은 따라 다르며, 그리고 초기 최적화가 필요합니다. 0.33 % 중립 빨간색 솔루션의 장기 저장이 야기됩니다. 이러한 경우에는 침전물이 완전히 55에 부화하여 해산 수 있습니다 ° 활발한 흔들어 다음 10 분 C. 시켰던 중립 R의 사용세포의 약한 얼룩에 에드 솔루션 결과, 잘하면서 다시 해산 중립 붉은 솔루션 얼룩 세포. - 16 접시를 품어 37 H (또는 야간) · 5퍼센트 CO 2 배양기에서 C.
- 물론 당 10-100 plaques를 포함하는 우물에 plaques의 개수를 계산합니다. 단위 / ML 형성 상패의 수를 계산합니다. 예를 들어, 우리는 10 -5 dilutions, 28 (# plaques의) × (1 ml/0.4 ML) × 10 5 (희석) = 7.0 X 10 6 플라크 형성 단위 (pfu)와 주사 우물 28 plaques를 관찰하면 / ML (피규어 5).
4. NSS 돌연변이 검사는 타입 - I IFN의 억제 기능을 부족
- 12 잘 접시에, NF - KB 및 IRF - 7분의 3 (그림 6)에 의해 분비 배아 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 (SEAP) 유전자 inducible를 인코딩 확산 C57/WT MEF 세포 (InvivoGen, 고양이 # mef - c57wt). 세포는 10% FBS 페니실린 - 스트렙토 마이신 (Penici과 DMEM으로 유지llin : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML), Blasticidin S (3 MG / ML) 및 Zeocin (100 μg / ML).
- 세포 (80 %) 하위 합류가되면 전지 모의 - 감염된 또는 MP - 12 또는 3 또는 0.1의 감염의 다중성 (방어) (섹션 2와 3을 참조 금액에 재조합 MP - 12 인코딩 NSS의 돌연변이에 감염된 각 inoculum은) 300 μl해야합니다. 1 H 게시물 감염에서 inocula을 제거와 10 % FBS 페니실린 - 스트렙토 마이신 (페니실린 : 100 U / ML, 스트렙토 마이신 : 100 μg / ML) 1 개 ML 당 잘 DMEM의 추가 (Blasticidin 및 Zeocin이에 추가되지 않습니다 시간).
- 14 H 게시물 감염에서, 문화 supernatants를 수집합니다. QUANTI - 블루 200 μl (InvivoGen, 고양이 # 담당자 - qb1) 및 96 - 웰 플레이트의 우물 각 시료 50 μl을 (세중의)를 추가합니다. 일 H.위한 37 판 ° C를 봉인하고 품어
* MP - 12 및 재조합 모두 MP - 12 부족 NSS는 분명히 293 세포, MRC - 5 세포와 마우스 embr 포함한 IFN-alpha/beta 유능한 세포 호스트 translational 억제를 유발높은 입니다만 14 시간 이후 감염 후 yonic fibroblast (MEF) 세포. 한편, IFN - 베타 mRNA 또는 ISG56 mRNA가 7에서 8 시간 이후 감염에 다량으로 축적 타입 - 내가 유능한 세포를 IFN. 따라서, 우리는 타고난 면역 반응에 의해 유도 SEAP의 축적을 볼 supernatants를 수집 14 시간 이후 감염을 선택했습니다. - 플레이트 리더 (그림 7)를 사용하여 650 nm의에서 OD 값을 읽어보십시오.
* 결과는 NSS 표현의 부재 (그림 8)에 ISG56 mRNA의 규제를 보여줍니다 마우스 ISG56 mRNA, 특정 RNA 프로브를 사용 북부 얼룩 얻은 데이터와 일치하고 있습니다.
* 이것은 SEAP 활동은 호스트의 번역 활동에 의해 영향을받을 수있는 단백질의 풍부에 의해 결정됩니다 것을 주목하여야한다. SEAP가도 SEAP mRNA의 존재에 합성 수 없기 때문에 휴대폰 번역이 suppr 경우 SEAP의 상대 수준은 mRNA의 증가 수준에 비해 높은 없을 수도essed. 북부 얼룩 좀 더 직접적인 분석과 SEAP 기자 분석보다 감염된 세포에서 NSS 기능의 부족에 의해 유도된 mRNA의 양을 평가하는 더 정확한 방법입니다. 그러나, SEAP 기자 시스템은 북부 얼룩보다 신속하고 잠재적으로 호스트 전사 억제 기능을 부족한 NSS 돌연변이의 빠른 검사 따라서 유용합니다.
5. 대표 결과 :
역방향 유전학 시스템은 지속적으로 1 × 10 6 pfu / ML 이상 titers와 가능한 재조합 MP - 12 바이러스를 생성. MP - 12은 다양한 크기의 2 (그림 5)의 명확한 plaques를 형성하면서 NSS의 기능을 부족 C13type 바이러스는, 큰 흐린의 plaques를 형성했다. C13type 감염된 C57/WT MEF 세포의 문화 뜨는가 증가를 포함한하면서 모의에 감염된 C57/WT의 MEF 세포 또는 MP - 12에 감염된 사람은 모의에 감염된 세포에 비해 문화 뜨는에서 SEAP의 수준을 증가시키지 않았14시간 게시물 감염 (hpi) (그림 7)에 의해 SEAP 수준. 이러한 결과는 마우스 ISG56 mRNA (그림 8) 특정 RNA 프로브를 사용 북부 얼룩 얻은 사람과 일치하고 있습니다.
RVFV의 그림 1. 게놈 구조
RVFV는 삼자 간의 부정적 - 감각 또는 ambisense RNA 게놈이라는 S -, M -, 및 L - 세그먼트.있다 S - 세그먼트 ambisense 방식으로 N 및 NSS 유전자를 인코딩합니다. NSS mRNA가 안티 - 바이러스 - 감각 (긍정적 의미) S - 세그먼트에서 합성되는 동안 N의 mRNA는 바이러스성 - 감각 (음성 - 의미) S - 세그먼트에서 합성됩니다. M - 세그먼트는 하나의 M의 mRNA를 인코딩하고 공동 translational 절단 22,23에 이어 M의 mRNA의 5'region 여러 AUGs의 새는 검색하여 the78kD, NSm, GN 또는 GC의 단백질을 합성. L - 세그먼트는 L 단백질을 인코딩합니다. GN와 GC는 바이러스 봉투 단백질 중에 N과 L 단백질 모두, 바이러스 전사 및 복제에 필수적인. NSS 및 NSm 단백질은 바이러스 입자에 포함되지 않습니다 nonstructural 단백질입니다.
그림 2.. 재조합 RVFV MP - 12 변형의 회복을위한 플라스미드 DNA의 설계
cDNA 인코딩 전체 길이 안티 바이러스 - 감각 S -, M -, 또는 L - 세그먼트 cloneddownstream T7 프로 모터와 상류 형 간염 델타 바이러스 (HDV)의 pProT7 - S (+)로 지정 ribozyme 시퀀스, pProT7 - M 아르 각각 (+) 또는 pProT7 - L (+), 2. BHK/T7-9 세포로 표현 T7 RNA 효소는 RNA 인코딩을 transcribes 전체 길이 S -, 정확한 게놈 3 '엔드와 M -, 또는 L - 세그먼트. N 또는 L 단백질의 열린 독서 프레임 (ORF)이 uncapped을 허용하도록 각각 pT7 - IRES - VN 또는 pT7 - IRES - VL로 지정되어 있습니다 encephalomyocarditis 바이러스 (EMCV) 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES), 아래에 복제 아르 T7 RNA 성적 증명서는 캡 - indepen의 변이에 의해 인정덴트 방식. M ORF가 새는 스캔 23 일까지 다양한 AUGs에서 생성됩니다 78kD의 합성, NSm, GN 및 GC 단백질을 허용하려면 pCAGGS - VG로 지정되어 플라스미드 pCAGGS 24의 닭고기 B - 굴지 모터 아래에 복제됩니다. pT7 - IRES - VN과 pT7 - IRES - VL은의 가정할 수있는 새는 표현으로 인해 아마도, 재조합 MP - 12 2의 복구를 위해 필수적인 것은 아니지만 N과 L 단백질 모두가 전사 또는 RNA의 복제를 시작하는 데 필요한 폴 - II 중심 각각 pProT7 - S (+) 및 pProT7 - L (+)에서 뒤덮인 RNA 성적 인코딩 N - ORF와 L - ORF.
그림 3. 플라스미드 DNA에서 RVFV MP - 12의 복구
pProT7 - S (+)와 BHK/T7-9 세포, pProT7 - M (+), pProT7 - L (+), pT7 - IRES - VN, pT7 - IRES - VL과 pCAGGS - VG plasmids (Fig.1의 Transfection ) 문화 뜨는에서 전염성 재조합 RVFV MP - 12 변형 생성S. 오일 게시물 transfection에 뜨는는 수집 및 바이러스 증폭을위한 신선한 Vero E6 세포로 passaged 있습니다. 일반적으로, 1 개 이상 X 10 6 pfu / 바이러스 ML은 3~4일 게시물 감염에서 복구할 수 있습니다. 증폭 바이러스 (E6P1 바이러스)는 Vero E6 세포와 함께 상패 분석을 사용하여 titrated 및 표현형 분석 및 immunogenicity 연구에 사용됩니다.
그림 4. MP - 12 S - 세그먼트와 rMP12 - C13type
MP - 12의 비교 및 rMP12 - C13type (C13type) S - 세그먼트. MP - 12 변형의 NSS에 비해 C13type의 NSS ORF는 69%에 의해 잘리고, 그리고 자연스럽게 분리된 클론 13 변형 2,25의 동일입니다.
그림 5. 상패의 MP - 12 (기능성 NSS)와 C13type (비 기능 NSS)에 대한 분석
Vero E의 monolayer6 잘 플레이트 6 전지는 상패 분석에 사용됩니다. 0.6 %의 한천 오버레이, 중성 붉은 솔루션을 포함하는 두 번째 한천 오버레이와 함께 삼일 부화가 추가되면. 그런 다음, plaques은 4 일 게시물 감염에 계산됩니다. MP - 12 양식을 다양한 크기의 명확 plaques, 동안 C13type는 형태의 대형 흐린의 plaques (또는 foci). 10-100 plaques와 잘가 계산을 위해 사용해야합니다.
그림 6. 분비 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SEAP) C57/WT MEF 세포에 리포터 유전자의 활성화 경로
인터페론 - 베타 모터는 AP - 1, NF - KB 및 IRF - 3의 바인딩 순서를 포함합니다. RVFV 복제는 AP - 1, NF - KB 및 IRF - 3 7,11을 활성화한다. 그러나, NSS는 IFN - 베타 mRNA 26함으로써 억제 합성, 심지어 그 전사 요소의 바인딩 후 IFN - 베타 발기인의 억제 복합의 석방을 억제. 또한, NSS sequesters TFIIH는 p44 subunits8과LSO 따라서 IFN - 알파 유전자와 ISRE 발기인에 따라 유전자를 포함하여 일반적인 호스트 전사 억제를 유도, TFIIH p62 subunits 27 저하를 추진하고 있습니다. IFN - 베타 억제 기능을 부족 C13type 또는 다른 NSS 뮤턴트 차례로 IFN - 알파 모터와 인터페론에 민감한 반응 요소 (ISRE) 발기인을 활성화 IFN - 베타 합성을 유도. IRF - 7은 IFN-alpha/beta의 자극과 IRF - 3 28,29 지원하는 IFN - 알파로 추가 upregulated하여 다음 transcriptionally upregulated입니다. 이 분석에서는 C57/WT MEF 세포는 NF - KB, IRF - 3과 IRF - 7의 인공 바인딩 순서의 하류에서 분비 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (SEAP)를 인코딩합니다. 따라서, IFN - 베타 억제 기능을 부족 NSS 돌연변이가 누구 분비 다음 측정 SEAP을 upregulate.
그림 7. C13type로 SEAP의 유도
C57/WT MEF 세포 (InvivoGen)이 모의되었다- 감염된 또는 MP - 12 방어 3 (왼쪽 패널) 또는 0.01 (오른쪽 패널)의시 rMP12 - C13type (C13type)에 감염된. 14 hpi에서 문화 supernatants (50 μl)가 QUANTI - 블루 (InvivoGen) 96 잘 플레이트와 650 nm의에서 OD 값의 기판 200 μl와 혼합되었다하는 것은 37 1 H 보육 ° C 플레이트 판독기에 의해 후에 측정되었다. 모의에 감염된 세포에 SEAP의 상대적 증가가 표시됩니다. 세 독립적인 실험 표준 편차 - 데이터는 의미 + /를 나타냅니다. C13type에 감염된 세포에서 문화 뜨는는 NSS에 의해 호스트 전사 억제의 부족을 제안, 증가 SEAP을 보여줍니다.
그림 8. 발굴 - 분류 RNA 프로브와 북부 얼룩
야생 형 마우스 배아 fibroblast (MEF) 세포가 모의 - 감염된 또는 MP - 12 방어 3시 rMP12 - C13type (C13type)에 감염된 있었다. 총 RNA는 Trizol (Invitrogen), 그리고 북부 B를 사용하여 7 hpi에서 수집된되었습니다많은 마우스 내생 ISG56 mRNA 또는 MP - 12 N의 mRNA / 안티 - 바이러스 - 감각 S - 세그먼트 2,30 특정 digoxigenin - 표시 RNA 프로브를 사용하여 수행되었습니다. 마우스 내생 ISG56 mRNA 또는 RVFV N mRNA / 안티 - 바이러스 - 감각 S - 세그먼트에 대한 프로브를 만들기위한, 뇌관에 의해 증폭 PCR의 조각 KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG 편대의 편대 장)과 HindmISG56 세트 (TAC AAA GCT 문신 GGG AGA GAA TGC TGG TGA TGA CCA GG) ISG56 mRNA 또는 KpnNF (AGT TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT TGC G)와 RVFV에 대한 HindNR (GGG CAA GCT TTT AGG CTG CTG TCT TGT AAG)에 대한 N의 mRNA / 안티 - 바이러스 - 감각 S - 세그먼트는 KPN과 함께 소화했다 I와 뒷다리 III, 그리고에 출혈도 잡았 pSPT18 플라스미드 (digoxigenin으로 표시 Roche. 그렇다면 RNA 프로브가 발굴 RNA 라벨링 키트 (SP6/T7) (Roche는를 사용하여 합성되었다 고양이 # 1 175 025)가. 각 샘플의 28S rRNA 수준도 컨트롤을로드로 표시됩니다. C13type 유도 ISG56 mRNA 합성에 감염된 야생 타입 MEF 세포는 이들은 MP에 감염하는 동안-12은 C13type에 감염된 세포에서 호스트 전사 억제의 부족을 제안, 그것을 유발하지 않았다. 데이터는 그림 6에서 SEAP 분석하여 얻은 사람과 일치합니다.
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Discussion
RVFV에 대한 유전학 시스템을 리버스는 T7 프로 모터 2,4,5 드나 마우스 3 인간 4 POL - I 프로 모터를 이용하여 여러 그룹에 의해 개발되었습니다. 이 원고에서는, 우리는 BHK/T7-9 세포 15되는 안정 표현 T7 RNA 효소를 사용하여 재조합 RVFV MP - 12 계통을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 바이러스 복구의 효율 BHK/T7-9 세포의 상태에 따라 다양, plasmids의 양을, transfected 세포 등등의 번호입니다. 우리는 항상 실험에 대한 높은 titer의 바이러스 주식을 취득 Vero E6 세포에서 P0 바이러스를 증폭. 이러한 인간의 폐 diploid (MRC - 5) 세포와 같은 타입 - I IFN - 관할 세포는 NSS 입력 - I IFN이나 PKR 포함한 억제 항바이러스 활동으로 효율적인 바이러스 복제를 지원하는 기능을 경우에만 바이러스 증폭에 사용될 수 있습니다.
플라크 분석은 MP - 12 NSS 돌연변이를 titrating위한 매우 유용한 방법입니다. 에 대한 일반적인 예방 차원에서플라크 분석은 세포는 즉시 바이러스 inocula의 제거 후 적절한 온도에서 오버레이로 추가되어야합니다. C13type 바이러스가 Vero E6 세포 2 monolayer를 방해하지 않기 때문에 크리스탈 보라색 얼룩은 C13type 바이러스 plaques를 감지에 적합하지 않습니다. 한편, 중립 붉은 얼룩이 성공적으로 C13type 바이러스에 의해 형성 plaques를 검색할 수 있습니다. 중립 빨간색과 세포 얼룩의 강도는 라이브 세포에 중성 붉은 염료의 상대적인 결합에 의해 결정됩니다. 그러므로, 그것은 C13type에 감염된 세포가 감염되지 않은 세포의 비교 중성 적색 색소의 감소 결합에 이르게 감소 신진 대사 활동을하고있는가 약한 얼룩 초점을 형성 가능성이 높습니다. 중립 빨간색의 필요한 금액은 중립 붉은 솔루션의 많은에 따라 다릅니다. 중립 붉은 솔루션의 장기 저장은 종종 precipitates를 생성합니다. 그러나, 이것은 열 용해 55에서 중립 빨간색 솔루션 ° 10 분 C의에 의해 예방할 수있다세포의 얼룩에 영향을 미칩니다.
실험에서 정확한 바이러스 titer와 함께 바이러스를 사용하는 것이 중요합니다. 바이러스의 재고 titer가 너무에 노란 바이러스의 재고 페놀 붉은 색, 장기 보관, 동결 - 해동 반복주기와로 표시됩니다 31 6.5 아래의 산도와 미디어에 의해 감소 될 수 있습니다. 따라서 동물의 예방 접종에 대한 신선한 바이러스 주식을 사용하거나 실험을하기 전에 다시 주식을 적정하다하는 것이 중요합니다.
NSS 및 NSm, RVFV 두 가지 특징 nonstructural 단백질을 인코딩합니다. RVFV 부족한 NSm 아직도 쥐 33 높은 악성 동안 RVFV 부족 NSS는 동물 25,32 크게 감쇠됩니다. 따라서, NSS는 pathogenesis의 독성 인자로서 중요한 역할을한다. NSS)는 dsRNA - DEP의 IFN - 베타 mRNA 합성 26 3 억제) 저하 호스트 일반적으로 전사 8 2 1) 억제를 유도 다기능 단백질이다endent 단백질 키나제 (PKR) 9,10. 부모의 MP - 12 변형은 NSS로 잘라내기 또는 변이를 도입하여 더욱 감쇠 수 있습니다. 한편, 이러한 돌연변이 MP - 12의 immunogenicity을 유지하는 것도 중요합니다. 타입 - I IFN은 T 세포와 B 세포의 12-14 differentiations 중요합니다 돌기 세포의 성숙을위한 역할을한다. 전체 또는 부분 NSS의 기능을 유지 IFN - 베타 억제 기능을 부족 다양한 NSS의 뮤턴트, 백신 후보의 immunogenicity 및 안전에 대한 NSS - 중재 IFN - 베타 억제 기능의 영향을 분석하는 데 유용합니다. 그것은 RVFV wt ZH548 스트레인 활성화 NF - KB, IRF - 3, AP - 1 (그림 6)에 감염된 세포가 IFN - 베타 mRNA 합성이 transcriptional 수준 7 NSS에 의해 억압되는 동안 것이 알려져 있습니다. 따라서, 완벽한 기능 NSS 3 표현 MP - 12, transcri에서 NF-kB/IRF-3/7-inducible의 SEAP의 리포터 유전자의 mRNA의 합성을 억제ptional 수준은 같은 C13type 같은 재조합 MP - 12 부족 NSS 기능은 SEAP mRNA 합성을 (그림 7) 유도있을 동안. 정확하게 이러한 돌연변이의 immunogenicity 결과를 이해하기 위해서 phenotypes는 더 세포 배양 시스템에 특성화해야합니다. 예를 들어, 바이러스 복제 속도론는 그러한 인간의 폐 diploid MRC - 5 세포 드나 마우스 배아 fibroblast (MEF) 세포 유형으로 IFN - I 유능한 세포에서 테스트해야합니다. PKR 저하 기능이 인간 또는 마우스 PKR 특정 항체와 서양 얼룩하여 테스트할 수 있습니다. NSS 돌연변이에 의한 IFN - 베타 mRNA 유도는 인간 또는 마우스 IFN - 베타 mRNA에 digoxigenin - 라벨 RNA 프로브 특정과 북부 얼룩으로 확인하여야한다. 호스트 일반 전사 억제는 초기 mRNA에 유리딘 아날로그의 결합을 분석하여 테스트할 수 있습니다. 결국 후보 MP - 12 NSS의 돌연변이의 immunogenicity 및 안전은 생쥐에서 테스트해야합니다. 칸디다의 일반적으로, 1 × 10 5 pfuPBS에 희석 테 백신은 subcutaneously 부여와 세라는 하루에 30 (또는 42)과 일 180에서 역 궤도 부비동에서 수집한 RVFV N에 대한 테스트를 중화 상패 감소 (PRNT 80)와 총 IgG에 의해 중화 항체의 존재를 테스트합니다 와 IgG 엘리사에 의해 GN / GC는 재조합 바이러스 단백질 정화와 코팅. 미국 반대로 동물 biosafety 수준 (BSL) 4 시설이나 향상된 BSL3 + 시설에서, (IP, 1 X 10 3 pfu 예) 백신 후보의 효능은 야생 형 ZH501와 42일 게시물 예방 접종에 도전 생쥐로 테스트할 수 유전학의 접근 방식은 설계와 안전하고 immunogenic 라이브 감쇠 RVFV 백신을 생성하는 강력한 도구입니다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 부여 5 번 우수 서양 지역 센터 (WRCE)를 통해 U54 AI057156 - 07, 알레르기 및 전염병 국립 연구소에서 1 R01 AI08764301 - A1, 그리고 대학에서 백신 개발을위한 Sealy 센터에서 내부 자금으로 투자되었다 텍사스 의료 지점.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
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