Selektion og isolering Kolonier af Human induceret pluripotente stamceller omprogrammeret fra voksne fibroblaster

Summary

Vi præsenterer en protokol til effektiv omprogrammering af humane somatiske celler i menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) ved hjælp af retrovirale vektorer koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) og identifikation af korrekt omprogrammeres hiPSC af levende farvning med Tra- 1-81 antistof.

Abstract

Heri præsenterer vi en protokol omprogrammering humane voksne fibroblaster i humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) under anvendelse af retrovirale vektorer, der koder Oct3 / 4, Sox2, Klf4 og c-myc (OSKM) i nærvær af natriumbutyrat ^1-3. Vi har brugt denne metode til at omprogrammere sent passage (> P10) humane voksne fibroblaster afledt af Friedreichs ataksi patient (GM03665, Coriell Repository). Omprogrammering fremgangsmåde omfatter højeffektive transduktion protokol under anvendelse gentagen centrifugering af fibroblaster i nærværelse af virus-holdige medier. De omprogrammerede hiPSC kolonier blev identificeret ved hjælp af levende immunfarvning for Tra-1-81 en overflademarkør af pluripotente celler, adskilt fra ikke-omprogrammerede fibroblaster og manuelt passeret ^4,5. Disse hiPSC blev derefter overført til Matrigel plader og dyrket i feeder-frie betingelser, direkte fra omprogrammering pladen. Startende fra den første passage, hiPSC kolonier viser karakteristiske HES-lIKE morfologi. Anvendelse af denne protokol mere end 70% af udvalgte kolonier med held kan udvides og etableret i cellelinier. De etablerede hiPSC linier viste karakteristiske pluripotens markører, herunder overflademarkører TRA-1-60 og SSEA-4, såvel som nukleare markører Oct3 / 4, Sox2 og Nanog. Protokollen præsenteres her er blevet etableret og testet ved hjælp af voksne fibroblaster opnået fra Friedreichs ataksi patienter og kontrolpersoner personer ^6, menneskelige nyfødte fibroblaster, såvel som humane keratinocytter.

Protocol

1. Virusproduktion og transduktion

1. Plade Phoenix ampho-celler ved en densitet på ~ 7-8x10 ⁶ pr 10 cm plade i 10 ml DMEM-medium (DMEM høj glucose, 10% FBS varmeinaktiveret, 2 mM L-glutamin, uden antibiotika). Sted i inkubatoren og kulturen natten over ved 37 ° C, _5% CO2.
2. De næste dag transficere Phoenix celler under anvendelse af 12 ug af en vektor, der koder for enten Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-myc, eller GFP-genet (Addgene plasmider 17.217, 17.218, 17.219, 17.220) og 35 pi Fugene 6. Forberede transfektion blandes i 500 pi af DMEM-medium (DMEM høj glucose, 2 mM L-glutamin, ikke FBS og antibiotika). Inkuber 20 min. Forsigtigt pipettere DNA-komplekser i de 10 cm plader indeholdende 70-80% konfluente Phoenix celler.
3. Erstatte medierne 6-8 timer efter transfektion med DMEM-medium (DMEM høj glucose, 10% FBS varmeinaktiveret, 2 mM L-glutamin) indeholdende penicillin og streptomycin.
4. Derefter indsamle virus-holdige medier 4 gange i 12 hmellemrum kombinere alle dele og filtreret ved anvendelse af et 0,45 um filter til fjernelse af løsnede celler og nedbrudt materiale (medium indeholdende virale partikler kan opbevares i køleskab i 2 uger uden at miste infektiøs aktivitet, men frysning ikke anbefales).
5. For retroviral transduktion, varmeplader human voksne fibroblaster (passage 10, Coriell Laboratories) fra en frossen lager 24 timer før den sidste dag i retroviral mediesamling. Frø cellerne på 6-brønds gelatine omfattet plader på de massefylde 1x10 ⁵ brønd i DMEM høj glucose, 10% FBS, 2 mM L-glutamin, penicillin, streptomycin og ikke-essentielle aminosyrer.
6. Den næste dag erstatte DMEM-medium med medier indeholdende virale partikler fremstillet fra Phoenix celler. Tilsættes virale medier (1 ml af hver Oct4, Sox2, Klf4 og c-myc medier, 4 ml total) suppleret med 6 ug / ml polybren i hver brønd i 6-brønds plade af fibroblastkulturer og der centrifugeres ved 1600 g i 1 time ved 20 ° C. Ca. 12 timer AFter den transduktion, erstatte de virale medier med fibroblast dyrkningsmedium. Udføre viral infektion og centrifugering 3 gange i 24 timers intervaller.
7. Kultur fibroblaster i DMEM-medium i 48 timer efter sidste infektion. Se af effektiviteten af ​​infektion med parallelle transduktion med en retroviral medie, der udtrykker GFP. Figur 1 illustrerer effektiviteten af ​​centrifugering, lettes retroviral infektion af human fibroblast.

2. Omprogrammering

1. Fremstille plader med 6 brønde med γ-bestrålede MEF fødelag ved podning MEF-celler ved en densitet på ~ 2x10 ⁵ celler per brønd af gelatinen behandlede 6 brønds plade i fibroblastvækstfaktor medium. Den følgende dag opdelt inficerede humane fibroblaster under anvendelse af 0,05% trypsin / EDTA og frø dem densitet ~ 1.2x10 ⁴ brønd i fibroblaster vækstmediet.
2. Den næste dag erstattes mediet med HES medier (DMEM/F12, 20% Knockout Serum erstatning, ikke-essentielle aminosyrer, penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 20 ng / ml basal fibroblast vækstfaktor (bFGF), suppleret med 0,5 mM natriumbutyrat i de første 7 dage efter omprogrammering. Ændre mediet dagligt.
3. Overvåge morfologiske ændringer i transducerede celler dagligt. Kolonier af HIPS-lignende celler vil begynde at opstå omkring 5 - 10 dage efter overførsel de transducerede fibroblasterne over på fødeceller. De hiPSC Kolonierne er klar til at blive isoleret omkring 14 - 28 dage efter udpladning dem MEF fødeceller.

3. Isolering af hiPSC kolonier

1. En dag før opsamling af de hiPSC kolonier fremstille 24-brønds plader med γ-bestrålede MEF fødeceller (ca. 4x10 ⁴ celler per brønd) i fibroblaster vækstmedium. På dette stadium hiPSC kolonier kan også overføres til føderen fri kultur med Matrigel og mTeSR1 medium.
2. Før isolering af hiPSC kolonier fremstille MEF plader ved fjernelse fibroblaster vækst medium og skylning MEF'er med PBS for at fjerne spor af FBS. Derefter tilsættes 0,5 ml hES medium (eller mTeSR1 medium i tilfælde af Matrigel coatede brønde) med 10 uM ROCK inhibitor Y27632 til hver brønd ^7,8.
3. Om nødvendigt fjernes fibroblasterne omgiver hiPSC kolonier med en 21 gauge nål under et mikroskop monteret i en laminar strømningshætte (figur 2A - C). Skylles pladerne med PBS, og der tilsættes frisk hES medier indeholdende Tra-1 til 81 StainAlive specifikt antistof (1:200, Stemgent). Efter 30 min. Erstatte medier indeholdende antistoffet med friske hES medium suppleret med 10 pM ROCK-inhibitor. Undersøg pladerne under fluorescerende mikroskop og mark Tra-1-81 positive kolonier efter en objektiv markør (Figur 2D).
4. Skåret Tra-1-81 positive hiPSC kolonier under et mikroskop i et laminært stinkskab og i adskillige små stykker med en 21 gauge nål, som vist i figur 2E og F.
5. Brug af en automatisk pipette (P200) overførsel fragmenter af hiPSC kolonier i individual brønde i 24-brønds plade med MEF'er eller Matrigel. Undgå at overføre ikke-hofter celler. Placere pladerne på en 37 ° C, _5% CO2 inkubator og tillade hiPSC kolonier at vedhæfte i 24-36 timer.
6. Ændring hES eller mTeSR1 (for kolonier dyrket på Matrigel) medier dagligt. De hiPSC kolonier med korrekt HES-lignende morfologi vil være synlig 48 timer efter den første overførsel til en 24-brønds plade.
7. Manuelt passage hiPSC kolonier hver 6. - 8 dage på en 12-brønd og derefter for en 6-brønds plade.
8. Efter klonal ekspansion og om hiPSC linjer analysere ekspression af pluripotens markører TRA-1-60, SSEA-4 Oct3 / 4, Sox2 og Nanog anvendelse immuncytokemi som vist i figur 3. Evaluere genomisk integritet og differentiering potentiale af de opnåede linjer med karyotype og teratom dannelse analyser ^6,9.

4. Repræsentative resultater

Effektiv transduktion med retrovirus-holdige medier is afgørende for en vellykket omprogrammering. Det anbefales at udføre hele transfektionen / infektion under anvendelse af en GFP-udtrykkende virus hver enkelt omprogrammering eksperiment for at overvåge effektiviteten som vist i figur 1. Titeren af GFP-udtrykkende virus bestemmes som beskrevet i ¹⁰ via transduktion af humane fibroblaster under anvendelse af ikke-koncentrerede virale medier var typisk i området 0,5 - 5 x 10 ⁷ viruspartikler per ml (VP / ml).

Fibroblaster ændre morfologi så tidligt som 2 dage efter sidste infektion. Trypsinerede humane fibroblaster bør omhyggeligt tælles inden podning dem MEF fødeceller. Det anbefales, at frø celler ved 3 forskellige densiteter (6x10 ^3, 1.2x10 ^4, 2.5x10 ⁴ pr enkelt brønd i en 6 brønds plade), idet hver cellelinje viser forskellige vækst karakteristisk og podningstæthed er kritisk for effektiviteten af omprogrammering. Natriumbutyrat, der anvendes tilindledende 7 - 14 dage omprogrammering forøger effektiviteten af ​​hiPSC dannelse cirka 5 gange. Ofte, især når inficerede fibroblaster blev podet ved højere densitet, kan de fibroblastlignende celler overvokse en dyrkningsskål og dække hiPSC kolonier, som vist i figur 2A. I dette tilfælde kan fibroblast lag omhyggeligt løftes og fjernes for at afdække hiPSC kolonier (figur 2B). Efterfølgende skal hiPSC kolonier skylles med HES medier og farvet med Tra-1-81 antistof. Afhængigt af fibroblastceller, cirka 20 - 40% af kolonierne viser med IPSC-lignende morfologi ikke farves med Tra-1-81 antistof. Identificerede hiPSC kolonier kan overføres fra en plade inden næste 12 - 24 timer. Forlænget inkubation vil resultere i hurtig differentiering af hiPSCs. Kolonier kan manuelt passeres til enten MEF fødeceller eller Matrigel-coatede plader. Efter ekspansion etableret hiPSC kloner testes under anvendelse af immuncytokemi (ICC) til ekspression af pluripotency markører som vist i figur 3. Endvidere bør en detaljeret molekylær karakterisering af de genererede iPS cellelinier omfatter: analyse af pluripotens genekspression ved hjælp af RT-PCR, demonstration af DNA demethylering ved promotorerne for pluripotens gener og analyser af transgenerne lyddæmpningssystemer ^9.

Figur 1. Effektiviteten af viral transduktion bestemt ved anvendelse af GFP-udtrykkende retrovirus. (A, B) voksent menneske fibroblaster afledt fra Friedreichs ataksi patient (GM03665, Coriell Repository) blev visualiseret efter to på hinanden følgende infektioner med GFP retrovirale medier. (C, D) Humane fibroblaster blev inficeret med den samme batch af GFP retrovirale medier efterfulgt af centrifugering af cellerne direkte på plader med 6 brønde i 1 time ved 1600 g. Billeder blev fanget 48 timer efter infektion.

Figur 2. Identifikation og isolering af hiPSC kolonier. (A) fasekontrast billede af en plade indeholdende hiPSCs omgivet af fibroblaster. Cellerne blev dyrket i 21 dage på hES medier. (B, C) Den samme hiPSC koloni efter fjernelse af den omgivende fibroblast lag. (D) Korrekt omprogrammerede hiPSC kolonier identificeres ved direkte farvning med Tra-1 til 81 overflademarkør antistof, skæres med en steril nål (E, F) og overføres til separate brønde i en 24-brønds plade.

Figur 3. Ekspression af pluripotens specifikke markører Oct3 / 4 Nanog, Sox2, SSEA4 og Tra-1-60 hiPSCs blev bestemt ved immunocytokemi.

Discussion

Forskning i menneskers sygdomme, især neurologiske og neurodegenerative, er blevet en særlig stor udfordring på grund af den manglende adgang til passende menneskelige cellulære modeller. Evnen til at omprogrammere let kan opnås somatiske celler i inducerede pluripotente stamceller og muligheden for at differentiere dem til forskellige celletyper åbnet en mulighed for at skabe cellulære modeller af genetiske sygdomme. Hertil kommer, at holde IPSC'er et stort løfte i fremtiden for regenerativ medicin. Derfor er det vigtigt at udvikle og optimere pålidelige, effektive og sikre metoder til omprogrammering somatiske celler til pluripotency.

Set fra terapeutiske anvendelser, er det afgørende at udvikle sikre tilgange af IPSC generation mangler fodaftryk mutationer i værtens genom. Fremgangsmåder til somatiske celler omprogrammering uden at indføre permanente ændringer i genomet af omprogrammerede celler, såsom transfektion af episomale vektorer, anvendelse af udskæres transposons og adenoviral infektion og direkte levering af mRNA eller protein er allerede blevet etableret ^11-15. Hidtil omprogrammering effektivitet ved hjælp af disse transgen-frie metoder er lav og afhænger af den karakter, type og alder omprogrammerede somatiske celler. Derfor er disse protokoller er ikke egnet til omprogrammering sent passage, voksne somatiske celler ofte deponeret i celle repositories. Derudover, så detaljeret karakterisering af flere IPSC linjer og at etablere nye modeller for humane sygdomme og til at udføre high-throughput-skærme, omprogrammering af somatiske celler ved hjælp af viral levering af transkriptionsfaktorer er en passende strategi. Til dato har mere end 20 studier rapporteret generation af patient-specifikke IPSC'er til model menneskelige neurologiske og neuromuskulære sygdomme. I alle undtagen én tilfælde IPSC'er blev frembragt under anvendelse lentiviral eller retroviral transduktion ^16.

Vore data viser, at en simpel protokol baseret på the retroviral afgivelse af OSKM transkriptionsfaktorer kan anvendes til effektivt at omprogrammere voksne humane fibroblaster, selv med en høj passage. Mængden af ​​virus opnået fra en enkelt transfektion af Phoenix celler på 10 cm plade er tilstrækkelig til mere end 10 reprogrammeringsdata eksperimenter. Der er tre kritiske trin i vores omprogrammering protokol voksne fibroblaster: (i) meget effektiv viral transduktion lettes ved et yderligere centrifugeringstrin ved transduktion som dramatisk øger effektiviteten af ​​transduktion (ii) podning densitet transducerede fibroblast på MEF'er og ( iii) anvendelse af levende farvning med Tra-1 til 81 markør antistof for at lette udvælgelsen af ​​potentielt fuldt omprogrammerede kolonier, som direkte kan overføres til feeder-frie kultur. Effektiviteten af ​​omprogrammering er forbedret betydeligt ved hjælp af natrium-butyrat i løbet af anden uge af omprogrammering. Desuden har vi observeret, at en større fraktion af IPSC kolonier dyrket iTilstedeværelsen af ​​lægemidlet kan udvides og etableret i fuldt omprogrammerede IPSC linier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
DMEM/F12	Invitrogen	11330
KSR	Invitrogen	10828
Non-essential aminoacids	Invitrogen	11140
Sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887
Y27632	Stemgent	04-0012
bFGF	Stemgent	03-0002
Tra-1-81 antibody	Stemgent	09-0069
Oct3/4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-8628
Nanog antibody	Cell Signaling Technology	4903S
Tra-1-60 antibody	EMD Millipore	MAB4360
Sox2 antibody	Cell Signaling Technology	3579S
SSEA4	EMD Millipore	MAB4304
CF1 MEFs	Globalstem	GSC-6201G
Objective marker	Nikon Instruments	MBW10010
Matrigel	BD Biosciences	354277
mTeSR1	Stem Cell Technologies	05850
β-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Fugene 6	Roche Group	11814443001
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Object marker	Nikon Instruments	MBW10010