Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com um<em> In vivo</em> Ensaio diurese para estudar a knockdown efeitos dos genes de interesse tem sobre a excreção de fluido do mosquito.
Este protocolo vídeo demonstra uma técnica eficaz para knockdown um determinado gene em um inseto e realizar um bioensaio romance para medir a taxa de excreção. Este método pode ser usado para obter uma melhor compreensão do processo de diurese em insectos e é especialmente útil no estudo da diurese no sangue de alimentação-artrópodes que são capazes de assumir uma grande quantidade de líquido em uma farinha de sangue única.
Este gene knockdown RNAi mediada combinado com um ensaio in vivo de diurese foi desenvolvido pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de RNAi mediada knockdown de genes Aquaporin sobre Aedes aegypti diurese mosquito 1.
O protocolo é configurado em duas partes: a primeira demonstração ilustra como a construção de um dispositivo de injeção simples mosquito e como preparar e injetar dsRNA para o tórax de mosquitos para RNAi mediada knockdown do gene. A demonstração segundo ilustra como determinartaxas de excreção em mosquitos usando um bioensaio in vivo.
O protocolo utilizado RNAi foi desenvolvido no laboratório de Alexander Raikhel da Universidade da Califórnia Riverside 6,7 e é semelhante a um protocolo publicado por Garver e Dimopoulos 4. A abordagem experimental mostrado neste protocolo de vídeo pode ser usado para estudar os genes envolvidos na diurese de insectos em uma configuração em in vivo. Os órgãos excretores dos insetos, os túbulos de Malpighi, têm atraído o interesse de gerações de pesquisadores como um sistema m…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Victoria Carpenter por seus comentários críticos deste protocolo.
Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
Scissors | Local vendor | ||
Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |