Summary
В этом протоколе мы объединим RNAi-опосредованной генов с
Abstract
Это видео демонстрирует протокол эффективный метод, чтобы нокдаун гена в частности насекомых и провести новые биопроб для измерения скорости экскреции. Этот метод может быть использован для получения более глубокого понимания процесса диурез у насекомых и особенно полезен при изучении диурез в питающимися кровью членистоногих, которые могут занимать огромное количество жидкости в одной еды кровь.
Это RNAi-опосредованной генной нокдаун в сочетании с в тесте диурез естественных условиях была разработана Хансен лабораторию для изучения влияния RNAi-опосредованной нокдаун аквапорин генов комара Aedes aegypti диурез 1.
Протокол установки из двух частей: первая демонстрация показывает, как построить простое устройство инъекции комаров и, как подготовить и ввести в дсРНК грудной клетки комаров для RNAi-опосредованной генной нокдаун. Вторая демонстрация показывает, как можно определитьвыделение ставок в использовании комаров в естественных условиях биопроб.
Protocol
Часть I - RNAi-опосредованной генной нокдаун во взрослой Aedes aegypti комаров. Для эксперимента обзор см. Рисунок 1.
1. дсРНК синтеза
- Обобщение конкретных генов dsRNAs против интересов и контроль dsRNAs. Примечание: Мы рекомендуем разработке праймеров для ПЦР-фрагментов в диапазоне от 300 до 500 пар оснований, расположенных на 3 'конце конкретных кДНК 2 и последовательности T7 праймер прилагается на 5' конце (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Уникальность фрагменты должны быть подтверждены BLASTN анализа 3.
- Используйте Ambion Megascript T7 Высокая доходность Kit транскрипции (Ambion, настольный реагентов), которая использует РНК-полимеразы Т7 для транскрипции реакции синтеза дсРНК. Примечание: аналогичный реагентов и комплекты доступны в других странах.
- Для очистки дсРНК, осадок хлористого лития, следуя инструкциям с Megascript комплект.
- После purificatиона, распустить дсРНК гранул в стерильной воде. Для обеспечения достаточной вязкости для микроинъекции, концентрация дсРНК не должна превышать 2 мкг / мкл.
2. Инъекция подготовка
- Простой микро инжектор может быть построена с помощью трубки, ножниц, металлической иглой, шприц 1 мл, а 1 мл пластиковой пипетки (см. Рисунок 2). Трубы должны быть сокращены до ~ 40 см в длину. Кроме того, автоматизированная микро инжектора могут быть использованы такие как Драммонд Nanojet II 4.
- Отрежьте кончик шприца (иглы хаб) в 2 мл балльной шкале и удалить голову резиновый поршень от поршня.
- Удар отверстие с помощью металлической иглы в голову резиновый поршень и место главы резиновый поршень обратно в иглу центром.
- Поместите иглу центра в один конец трубки и поместить 1 мл пластиковые пипетки на другом конце, который будет использоваться в качестве рот кусок (или, 10 мл сиRinge может быть использован для создания давления воздуха необходимого для инъекций).
- Поместите стеклянный капилляр иглу в отверстие в голове резиновой поршень и разбить кончик иглы от так ширины является достаточно большим для жидкости течь через. Примечание: оптимальный размер иглы должен быть определен эмпирически - если ширина иглы слишком велик это приведет к травме и высокая смертность комаров, если игла ширина слишком мала, то это будет невозможно проникнуть комара экзоскелет.
- Опустите иглу в готовом образце дсРНК и привлечь жидкого образца в инъекционной иглой, высасывая жидкость с рот кусок (или шприца). Примечание: Этот шаг не является одинаковым для всех жидких реагентов, которые вводятся в комаров, в том числе PBS буфера, который используется в естественных условиях в протокол анализа диурез (см. ниже).
3. Сбор и обезболить комары
- Сборт комаров с питанием от батареи аспиратор в коллекцию флаконе. Поместите колпачок флакона коллекцию и поместить во флакон на чистую CO 2 площадки, чтобы обезболить комаров. Примечание: В качестве альтернативы могут быть комары анестезии на льду.
4. Mosquito инъекций
- Откройте коллекцию флакон и поместите комаров прямо на CO 2 площадки и ждать, пока комары наркозом.
- Выбросьте все мужчины.
- Выстроить комаров на стороне, чтобы обеспечить более легкий доступ для инъекций.
- Возьмите комаров за ноги или крылья, чтобы избежать травм. Вы также можете использовать штраф кисть или перо для управления комаров.
- Когда все будет готово для введения первого комара, мягко поддерживать одну из сторон грудной клетки с пинцетом и вставить кончик иглы в сторону грудной клетки (рис. 2). Лучше вводить в тонкую часть кутикулы и не подталкивать иглуО глубоко в грудной клетке.
- Как только игла находится в месте, удар жидкости в организме комара. Желаемая сумма может быть определена путем контроля мениска жидкости в иглу. Число миллиметров необходимых для определенного объема может быть определена путем расчета объема цилиндра стеклянный капилляр иглы (тгг 2 ч). Эффективное количество дсРНК, который обычно используется для инъекций составляет 1 мкг.
- Как только жидкость впрыскивается в комара, тщательно убрать иглу. Если большие капли жидкости образуется на внешней стороне грудной клетки, комар должен быть уничтожен. Затем повторите этот процесс со следующего комара.
5. Восстановление комаров и хранение
- После инъекции, поставить комаров в контейнер для хранения. Например, одна пинта воск выстроились картонные стаканы (суп чашки) с сетчатым покрытием, обеспеченные картонной крышкой. Крышка имеет часть вырезать для сетки покрытие подвергается воздействию. После того как все моментовsquitoes помещают в контейнер, поместите контейнер в экологически контролируемых камеры для инкубации и обеспечить комаров с источником питания, например, 20% сахарозы, пропитанной ватные шарики размещены в верхней части сетки покрытие. Перед проведением анализа в естественных условиях диурез, лишить дсРНК впрыском комаров источник воды в течение 12 часов по стандартизации гидратации состояние каждого комара.
- Эффективность дсРНК опосредованного генной нокдаун может быть переменной. Генов может начаться 1 день после введения, и это может длиться до 6 дней после введения 4. Оптимальное время для достижения максимальной нокдаун гена должен быть определен эмпирически для каждого гена используется. Как правило, мы будем ждать 3 дня после инъекции дсРНК прежде чем мы продолжим.
Часть II - в анализе естественных диурез у взрослых комаров Aedes aegypti
Примечание: Этот протокол был разработан авторами идля RNAi-опосредованной нокдаун аквапорин белки в желтой лихорадки комара Aedes aegypti 1. Чтобы избежать изменчивость между отдельными комары, москиты должны быть проанализированы в группах. По техническим причинам мы рекомендуем группы из 5 комаров на лечение - есть ограниченное количество времени для выполнения первого измерения веса до комары начинают выделять мочу после инъекции.
6. Сбор и обезболить комары
- Прежде чем коллекция комаров, записывать вес пустой флакон коллекции с крышкой использованием аналитических весов точность. Этот флакон будет использоваться для всех последующих измерений.
- Соберите 5 самок комаров в коллекции весил флакон с аспиратором. Установите колпачок на флакон коллекции и оставьте на CO 2 площадки в течение нескольких секунд, чтобы обезболить комаров.
7. Начальные измерения веса
- Возьмем тОн начального измерения веса 5 комаров, поместив флакон, содержащий коллекцию комаров с крышкой на точность баланса.
- Рассчитать вес группы из 5 комаров, взяв вес комаров и сбор флакон с крышкой и вычитания веса пустого флакона коллекцию с крышкой.
- Откройте коллекцию флакон и поместите комаров прямо на CO 2 площадки после записи вес комаров. Если комары начинают просыпаться во время взвешивания, установить флакон на CO 2 площадки в течение нескольких секунд перед его открытием и размещения комаров на площадку.
8. Инъекция подготовка
- Установить микро инжектор, следуя инструкциям в RNAi-опосредованной протокол нокдаун гена.
- Поместите стеклянный капилляр иглу в микро-инжектор и разбить кончик иглы от так ширины является достаточно большим для жидкогоUID, течь через.
- Опустите иглу в буфере PBS и сделать буфер в инъекционной иглой, желаемую сумму для использования этого протокола составляет 1,25 мкл PBS для каждого комара. Примечание: Эта сумма имитирует среднее количество плазмы крови, которые занимают Самка комара 5.
9. Mosquito инъекций
- Линия до комаров, чтобы обеспечить легкий доступ с микро форсунки.
- Как только игла находится в месте, взрывать PBS буфера в комара.
- Как только жидкость впрыскивается в комара, капли могут образовываться на внешней стороне грудной клетки. Это капля должна быть тщательно удалены до следующего шага.
- Повторите этот процесс инжекции со следующего комара. С опытом, москитные выживаемость будет практически 100% после инъекции.
10. Взвешивание комары
- После укола, осторожно положите комаров в коллекции флаконеи кепка. Возьмите первый измерения веса 5 комаров, поместив флакон, содержащий коллекцию комаров с крышкой на точность баланса.
- Рассчитать вес группы из 5 комаров, взяв вес комаров и сбор флакон с крышкой и вычесть вес пустой флакон коллекции с крышкой. Примечание: комары начинают выделять мочу в течение 2 минут после извлечения из CO 2 анестезии площадки, поэтому важно, чтобы взять вес измерения, прежде чем они начинают выделять.
- Поместите комаров в небольшой контейнер, в котором они начнут выводить мочу.
11. Второй и последующие измерения веса
Примечание: Взвешивание комары должны быть приняты в 30-минутными интервалами, но это может быть настроен на более или менее длительные интервалы в зависимости от выделения ставок.
- Через 30 минут собрать Grouстр. 5 комаров с аспиратором в одном флаконе с крышкой коллекции. Сделайте следующий измерения веса комаров путем размещения коллекции флакон, содержащий комаров с крышкой на точность баланса.
- После измерения, поместить комаров в одном контейнере холдинга в течение следующих 30 минут.
- Повторите этот процесс для необходимого количества времени.
12. Определение скорости выведения комаров
- Общий объем жидкости, который был введен в группе из 5 комаров можно рассчитать путем вычитания начального веса комаров от веса сразу после инъекции.
- Количество мочи, которая выделяется группа комаров в определенный момент времени может быть рассчитана путем вычитания начального веса комаров от веса комаров на определенный момент времени.
- Выделение скорости в определенный момент времени может быть рассчитана по дивиДин количество мочи выделяется в это время точка на общее количество жидкости впрыском (табл. 1).
13. Представитель Результаты
RNAi-опосредованной генной нокдаун и в анализе диурез естественных условиях были использованы Хансен лабораторию для изучения влияния аквапорины в Aedes aegypti комаров диурез. Три аквапорины, которые выражаются в Aedes aegypti мальпигиевы сосуды были сбиты с существенного влияния на выведение ставки по сравнению с контрольной комаров 1. На рисунке 4 показана представитель результаты эксперимента, в котором диурез анализ был использован для сравнения выделение ставок между Aedes aegypti и Culex quinquefasciatus при различных температурах.
Рисунок 1. Блок-схема RNAi / диурез анализа. 5 групп по 10 шт комаровч вводят дсРНК для конкретного гена и еще пять групп из десяти комары вводят контроль дсРНК. Другая группа комары вводят 200 мкМ HgCl 2 в PBS используется в качестве положительного контроля. Эти комары взвешивают перед инъекцией, а после введения в тридцати минутным интервалом в течение 3 часов.
Рисунок 2. Простое устройство микро инъекций для RNAi-опосредованной генной нокдаун и в анализе диурез естественных условиях. А. Стеклянный капилляр иглы для инъекций. Серый треугольник представляет миллиметра шагом обращено на иглу, чтобы указать количество жидкости вводят в комара. B. 1 мл шприц используется для построения микро-инжектора. Белый треугольник представляет иглы ступицы и черный треугольник представляет голову резиновый поршень прикреплен к поршень в шприце. С трубкой используется для подключения к мундштукинжектора. Д. 1 мл одноразовый наконечник пипетки (синий кончик), который используется в качестве рупора микроинъекции устройства. Е. микроинъекции устройство, которое включает в себя части нашей эры. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Оптимальное место инъекции комара. А. Женский Aedes aegypti комаров вводят стеклянный капилляр иглу между больших масштабах на груди. Черная полоса указывает на 1 мм для сравнения размеров. В. рисунок женской груди комаров и белые пятна представляют собой белые чешуйки в организме комара экзоскелет. Инъекции игла должна прокалывать комаров между пятнами, чтобы минимизировать смертность во время инъекции.
Рисунок 4. Воздействие температурытуры на Culex quinquefasciatus и Aedes aegypti диурез. диурез анализ был выполнен с двумя видами комаров, Aedes aegypti и Culex quinquefasciatus, при различных температурах. Скорость выделения в течение первого часа после укола в процентах.
| Группа | TARA (Г) | не вводится (Г) | после введения (Г) | 1 час после инъекции (Г) | Средний вес (мг) | Сумма вводится (Мкл) | Сумма выделяемых (Мкл) | % Экскретируется |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2,6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Таблица 1. Aedes aegypti в естественных результатах диурез анализа. Исходные данные из анализа диурез в естественных условиях осуществляется с Aedes aegypti самок комаров при 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол RNAi использоваться была разработана в лаборатории Александр Райхель из Университета Калифорнии Riverside 6,7 и похож на протокол опубликован Гарвер и Dimopoulos 4. Экспериментальный подход показано в этом видео, протокол может быть использован для изучения генов, участвующих в насекомое диурез в в естественных условиях. Выделительные органы насекомых, мальпигиевых канальцев, привлекли внимание многих поколений исследователей, как "простой" модельной системы для диурез. Этот орган занимается ксенобиотиков зазор 8 и работа у дрозофилы выявил многочисленные гены, участвующие в мальпигиевых трубочку физиологии 9,10 которой теперь могут быть изучены в других насекомых с обратной генетические методы, как РНК-интерференции. Многие гомологичные гены могут быть легко определены в опубликованной последовательности геномов различных видов насекомых 11. Три дневных комаров были использованы в данном протоколе, потому что в это время поинт они становятся компетентными, чтобы принять кровь еды.
Несколько других методов выделения не поступало. Классический анализ Рамсей был использован для изучения диурез в изолированных мальпигиевы сосуды в пробирке 12. В данном анализе одной трубочки изолированы и дистальной части помещаются в каплю физиологического раствора, а проксимальная часть открыта. Мочегонные деятельности рассчитывается путем измерения размеров капли мочи, которая образует в конце проксимальной части. Используя анализ Рамсей, можно измерить количество мочи производства отдельных мальпигиевых трубочек. Наш анализ позволяет диурез для измерения целого комара ставки выведение и, следовательно, не является альтернативой Рамсей анализа. Вместо этого, как тесты могут предоставить дополнительную информацию, если они используются вместе.
Другие анализы в естественных условиях выделения были разработаны для Musca Domestica и Aedes aegypti. М. Domestica исследования связаны сг измерение потери воды проточным измеритель влажности 13. Подобная техника была использована для изучения Aedes aegypti диурез путем измерения экскреции ставки, используя точность камере влажности 14. В анализе диурез естественных, представленные здесь, не так технически сложных, как и вышеупомянутые методы и тем не менее дает очень точные данные о выделение ставок в контексте целостного организма.
Существует широкий диапазон будущих приложений в естественных условиях диурез анализа, представленные здесь. В дополнение к обратной генетики методы, такие как РНК-интерференции может быть использована для изучения влияния лекарственных препаратов, например сигнала ингибиторов и т.д., на насекомых диурез. Это также мощный анализ для изучения процесса оформления ксенобиотиков в целевых насекомых.
Проблемы, которые мы будем решать в то время как дальнейшее развитие этого анализа являются: а) концентрация и состав инъекции буфера. Мыиспользоваться PBS для экспериментов мы провели до сих пор, но и другие буферы, как Aedes физиологическим 15 может оказаться более подходящим для комаров и других насекомых. Б) применение этого метода к другим видам, в частности, не кровь сосущие насекомые. Количество буферов, которые могут быть введены такие виды должны быть эмпирически определяется для каждого вида. C) Свернуть погрешности эксперимента. Мы будем оптимизировать впрыск и измерительной техники.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Виктории Карпентер ее критические замечания этого протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
