Summary
En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con un
Abstract
Este protocolo vídeo muestra una técnica efectiva para derribar a un determinado gen en un insecto y llevar a cabo un bioensayo de la novela para medir la tasa de excreción. Este método puede utilizarse para obtener una mejor comprensión del proceso de la diuresis en insectos y es especialmente útil en el estudio de la diuresis en los artrópodos se alimentan de sangre que son capaces de tomar grandes cantidades de líquido en un solo harina de sangre.
Esta caída de genes mediante RNAi en combinación con un ensayo in vivo la diuresis fue desarrollado por el laboratorio de Hansen para estudiar los efectos de RNAi mediada desmontables de genes acuaporina en Aedes aegypti, mosquito diuresis 1.
El protocolo está configurado en dos partes: la primera demostración ilustra cómo construir un dispositivo simple inyección de mosquitos y cómo preparar e inyectar dsRNA en el tórax de los mosquitos para la caída de genes mediante RNAi. La segunda demostración ilustra cómo determinarlas tasas de excreción de los mosquitos utilizando un bioensayo in vivo.
Protocol
Parte I - RNAi mediada desmontables gen en los mosquitos adultos Aedes aegypti. Para panorama experimento véase la figura 1.
1. dsRNA Síntesis
- Sintetizar ARN de doble cadena específicos contra de los genes de ARN de doble cadena de interés y el control. Nota: Se recomienda cebadores en desarrollo para fragmentos de PCR en el intervalo de 300 a 500 pares de bases situadas en el extremo 3 'del ADNc específico y 2 con la secuencia del cebador T7 unido en el extremo 5' (5'-TAA TAC CAG TCA CTA TAG GG-3 '). Singularidad de los fragmentos debe ser confirmado por análisis de BLASTN 3.
- Utilice la Ambion Megascript T7 Alto Rendimiento Kit de transcripción (Ambion, tabla de reactivos) que utiliza la RNA polimerasa T7 para la reacción de transcripción para sintetizar ARN bicatenario. Nota: Los reactivos similares y kits están disponibles en otros lugares.
- Para purificar el ARN bicatenario, precipitar con cloruro de litio siguiendo las instrucciones con el kit de Megascript.
- Después de purificatiónico, disolver el precipitado dsRNA en agua estéril. Para asegurar una viscosidad adecuada para la microinyección, la concentración de ARN bicatenario no debe exceder de 2 g / l.
2. Preparación de la inyección
- Un simple inyector micro puede ser construido mediante el uso de tubos, tijeras, una aguja de metal, una jeringa de 1 ml y 1 ml de una pipeta de plástico de punta (ver Figura 2). El tubo debe ser cortado a ~ 40 cm de longitud. Alternativamente, un inyector automático de micro se puede utilizar como Drummond Nanojet II 4.
- Cortar la punta de la jeringa (cubo de la aguja) en 2 ml de marca de la escala y retirar la cabeza del émbolo de caucho del émbolo.
- Haz un agujero con una aguja de metal en la cabeza del émbolo de caucho y el lugar de la cabeza del émbolo de caucho de nuevo en el cubo de la aguja.
- Coloque el cubo de la aguja en un extremo de la tubería y colocar un 1 ml de punta de pipeta de plástico en el otro extremo, que se utiliza como la boquilla (alternativamente, un 10 ml SyRinge puede ser utilizado para producir la presión de aire necesaria para inyección).
- Colocar una aguja capilar de vidrio en el agujero en la cabeza del émbolo de caucho y romper la punta de la aguja de modo que el ancho es lo suficientemente grande para el líquido fluya a través. Nota: El tamaño óptimo de la punta de la aguja tiene que ser determinada empíricamente - si el ancho de la aguja es demasiado grande esto dará lugar a un trauma y una alta tasa de mortalidad de mosquitos, si la anchura de la aguja es demasiado pequeña, será imposible penetrar el exoesqueleto del mosquito.
- Sumerja la aguja de inyección de la muestra preparada dsRNA y extraer la muestra de líquido en la aguja de inyección por la succión del líquido con la pieza en la boca (o una jeringa). Nota: Este paso es idéntica para todos los reactivos líquidos que se inyectan en los mosquitos, incluyendo tampón PBS, que se utiliza en el protocolo de ensayo in vivo la diuresis (véase más adelante).
3. Recoger y Anestesie mosquitos
- Colectat los mosquitos con un aspirador de potencia de la batería en un vial de recolección. Coloque una tapa sobre el tubo de recolección y coloque el frasco en una plataforma de CO 2 limpia para anestesiar a los mosquitos. Nota: También los mosquitos pueden ser anestesiados en el hielo.
4. Mosquito de inyección
- Abra el tubo de recolección y colocar los mosquitos directamente en la plataforma de CO 2 y espere a que los mosquitos que están anestesiadas.
- Deseche todos los hombres.
- Alinear los mosquitos en el lado para permitir un acceso más fácil para la inyección.
- Coge los mosquitos por las patas o alas para evitar lesiones. También puede utilizar un pincel fino o una pluma para manipular los mosquitos.
- Cuando esté listo para inyectar el mosquito primero, suavemente apoyar un lado del tórax con las pinzas e insertar la punta de la aguja en el otro lado del tórax (Figura 2). Es mejor inyectar en una porción delgada de la cutícula y no empujar la aguja ao profunda en el tórax.
- Una vez que la aguja está en su lugar, sople el líquido en el mosquito. La cantidad deseada se puede determinar mediante la supervisión del menisco de líquido en la aguja. El número de milímetros necesarios para un volumen específico se puede determinar calculando el volumen del cilindro de la aguja capilar de vidrio (πr 2 h). La cantidad efectiva de dsRNA que se utiliza típicamente para la inyección es 1 g.
- Una vez que el líquido se inyecta en los mosquitos, cuidadosamente retraer la aguja. Si se forma un líquido grandes gotas sobre la parte exterior del tórax, el mosquito debe ser desechado. A continuación, repita este proceso con el mosquito que viene.
5. Mosquito recuperación y almacenamiento
- Después de la inyección, colocar los mosquitos en un contenedor para el almacenamiento. Por ejemplo, una cera pinta alineados tazas de cartón (tazas de sopa) con malla revestimiento asegurado con la tapa de cartón. La tapa tiene una porción cortada para la malla que cubre a estar expuesto. Una vez que todo el MOsquitoes se colocan en el recipiente, colocar el recipiente en una cámara de ambiente controlado para la incubación y proporcionar a los mosquitos con una fuente de alimento, tales como bolas de sacarosa al 20% de algodón empapado colocados en la parte superior de la cubierta de malla. Antes de realizar el ensayo de la diuresis vivo, privar a los mosquitos dsRNA inyección de una fuente de agua durante 12 horas para normalizar el estado de hidratación de cada mosquito.
- La eficiencia de gen desmontables dsRNA mediada puede ser variable. El silenciamiento génico podría comenzar un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección 4. El tiempo óptimo para alcanzar gen desmontables máxima tiene que ser determinada empíricamente para cada gen utilizado. Generalmente, esperar 3 días después de la inyección de dsRNA antes de proceder.
Parte II - En el ensayo de la diuresis vivo en adultos del mosquito Aedes aegypti
Nota: Este protocolo ha sido desarrollado por los autores yutilizado para RNAi mediada desmontables de las proteínas acuaporinas en el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti 1. Para evitar la variabilidad entre los mosquitos individuales, los mosquitos deben ser analizados en los grupos. Por razones técnicas, se recomienda grupos de 5 mosquitos por el tratamiento - no hay una cantidad limitada de tiempo para realizar la medición de peso antes de los mosquitos comienzan a excretar la orina después de la inyección.
6. Recoger y Anestesie mosquitos
- Antes de la recolección de los mosquitos, registrar el peso de un frasco de colección vacía con una tapa con una balanza de precisión analítica. Este vial se utilizará para todas las mediciones subsiguientes.
- Recoger 5 mosquitos hembra en el vial colección pesaron con un aspirador. Coloque la tapa sobre el tubo de recolección y dejar que repose en la plataforma de CO 2 durante varios segundos para anestesiar a los mosquitos.
7. Medición de peso inicial
- Tome tque la medición del peso inicial de los 5 mosquitos colocando el vial de recogida que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión.
- Calcular el peso del grupo de 5 mosquitos tomando el peso de los mosquitos y el vial de recogida con el casquillo y restando el peso del frasco con tapa colección vacía.
- Abra el tubo de recolección y colocar los mosquitos directamente en la plataforma de CO 2 después de registrar el peso de los mosquitos. Si los mosquitos están empezando a despertar en las mediciones de peso, dejar reposar el vial en la plataforma de CO 2 durante varios segundos antes de abrirlo y colocar a los mosquitos en el teclado.
8. Preparación de la inyección
- Configure el inyector de micro siguiendo las instrucciones que figuran en el protocolo de genes mediante RNAi desmontables.
- Colocar una aguja capilar de vidrio en el inyector de micro y romper la punta de la aguja de modo que el ancho es lo suficientemente grande para liquid para fluir a través.
- Sumergir la aguja en tampón PBS y extraer el tampón en la aguja de inyección, la cantidad deseada a utilizar para este protocolo es de 1,25 l de PBS por cada mosquito. Nota: Esta cantidad imita la cantidad media de plasma de la sangre que se toma por un mosquito hembra 5.
9. Mosquito de inyección
- Alinear los mosquitos para permitir un acceso más fácil con el inyector de micro.
- Una vez que la aguja está en su lugar, un golpe de tampón PBS en el mosquito.
- Una vez que el líquido se inyecta en el mosquito, una gotita podría formar en la parte exterior del tórax. Este gota tiene que ser cuidadosamente eliminado antes de la etapa siguiente.
- Repita este proceso de inyección con el mosquito que viene. Con la experiencia, la tasa de supervivencia de los mosquitos será casi el 100% después de la inyección.
10. Los mosquitos de pesaje
- Después de la inyección, coloque suavemente los mosquitos en el tubo de recoleccióny la tapa. Tomar la primera medición del peso de los 5 mosquitos colocando el vial de colección que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión.
- Calcular el peso del grupo de 5 mosquitos tomando el peso de los mosquitos y el vial de recogida con tapa y restar el peso del frasco con tapa colección vacía. Nota: los mosquitos comienzan a excretar la orina a los 2 minutos después de la eliminación de la almohadilla de la anestesia de CO 2, lo que es importante para tomar la medida de peso antes de comenzar a excretar.
- Coloque los mosquitos en un pequeño recipiente donde se comienzan a excretar orina.
11. La segunda y subsiguientes mediciones de peso
Nota: las mediciones de peso de los mosquitos se debe tomar en intervalos de 30 minutos, pero esto se puede ajustar a intervalos cortos o más largos, dependiendo de las tasas de excreción.
- Después de 30 minutos, recoge el Grouwp de 5 mosquitos con un aspirador en el vial de la misma colección con tapa. Tomar la medición siguiente peso de los mosquitos, colocando el vial colección que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión.
- Después de la medición, colocar los mosquitos en el contenedor misma explotación para los próximos 30 minutos.
- Repetir este proceso para una cantidad de tiempo deseado.
12. Mosquito La determinación de la tasa de excreción
- La cantidad total de líquido que se inyecta en el grupo de 5 mosquitos puede ser calculado restando el peso inicial de los mosquitos a partir del peso inmediatamente después de la inyección.
- La cantidad de orina que se excreta por el grupo de mosquitos en un punto específico de tiempo puede ser calculado restando el peso inicial de los mosquitos desde el peso de los mosquitos en el punto de tiempo específico.
- La tasa de excreción en un punto específico de tiempo puede ser calculado por divisiónrepique la cantidad de orina excretada en este punto de tiempo por la cantidad total de líquido inyectado (Tabla 1).
13. Los resultados representativos
RNAi mediada desmontables gen y en el ensayo de la diuresis in vivo han sido utilizados por el laboratorio de Hansen para estudiar los efectos de las acuaporinas en la diuresis Aedes aegypti mosquito. Tres acuaporinas que se expresan en los túbulos de Malpighi Aedes aegypti fueron derribados con efectos significativos en las tasas de excreción en comparación con el control de mosquitos 1. La figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento en el que ha sido el ensayo de la diuresis utiliza para comparar las tasas de excreción entre el Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus a diferentes temperaturas.
Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo ARNi / diuresis. 5 grupos de 10 mosquitos eaCH son inyectados con ARNdc para un gen específico y otros cinco grupos de diez mosquitos son inyectados con el control dsRNA. Otro grupo de mosquitos inyectados con 200 HgCl 2 mM en PBS se utiliza como control positivo. Estos mosquitos se pesan antes de la inyección, y después de la inyección en intervalos de treinta minutos durante 3 horas.
Figura 2. Un sencillo dispositivo de inyección de micro para la caída del gen mediante RNAi y en el ensayo de la diuresis vivo. A. Las agujas capilares de vidrio utilizada para la inyección. El triángulo gris representa los incrementos milimétricas dibujadas en la aguja para indicar la cantidad de inyección de líquido en el mosquito. B. 1 ml jeringa utilizada para construir el inyector de micro. El triángulo blanco representa el cubo de la aguja y el triángulo negro representa la cabeza del émbolo de goma en el émbolo de la jeringa. C. El tubo utilizado para fijar la boquilla parael inyector. D. 1 ml punta de la pipeta desechable (punta azul) que se utiliza como la boquilla del dispositivo de microinyección. E. El dispositivo de microinyección que incorpora partes de AD. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Mosquitos óptimo lugar de la inyección. A. Mujer mosquito Aedes aegypti inyecta con una aguja capilar de vidrio entre las grandes escalas en el tórax. La barra de color negro indica 1 mm para la comparación de tamaño. B. Un dibujo del tórax mosquito hembra y los puntos blancos representan las escamas blancas en el exoesqueleto de los mosquitos. La aguja de inyección debe perforar el mosquito entre los puntos para minimizar la tasa de mortalidad durante la inyección.
Figura 4. Efectos de la temperaturatura de Culex quinquefasciatus y la diuresis Aedes aegypti. El ensayo se llevó a cabo la diuresis con dos especies de mosquitos, Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus, a diferentes temperaturas. La tasa de excreción durante la primera hora después de la inyección se da en tanto por ciento.
| Grupo | TARA (G) | no inyectada (G) | después de la inyección (G) | 1h después de la inyección (G) | peso medio (mg) | cantidad inyectada (L) | cantidad excretada (L) | % Se excreta |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2.6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabla 1. Aedes aegypti en los resultados de ensayo in vivo de la diuresis. Los datos básicos del ensayo de la diuresis in vivo realizado con el Aedes aegypti hembra del mosquito a 4 ° C.
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Discussion
El protocolo utilizado ARNi se ha desarrollado en el laboratorio de Alexander Raikhel en la Universidad de California Riverside 6,7 y es similar a un protocolo publicado por Garver y Dimopoulos 4. El método experimental se muestra en este protocolo de vídeo puede ser utilizado para estudiar los genes implicados en la diuresis de insectos en un entorno en vivo. Los órganos excretores de los insectos, los tubos de Malpighi, han atraído el interés de las generaciones de investigadores como un sistema "simple" modelo de la diuresis. Este órgano está involucrado en el aclaramiento de xenobióticos 8 y el trabajo en Drosophila ha identificado numerosos genes implicados en el túbulo de Malpighi fisiología de 9,10, que ahora puede ser estudiado en otras especies de insectos con métodos genéticos inversa como RNAi. Muchos genes homólogos pueden ser fácilmente identificadas en las secuencias del genoma publicado de diversas especies de insectos 11. Tres días de los mosquitos de edad fueron utilizados en este protocolo, porque en este tiempo point que ser competente para tomar una comida de sangre.
Varios ensayos de excreción se han reportado otros. El ensayo clásico de Ramsay ha sido utilizado para estudiar la diuresis en tubos de Malpighi aislados in vitro 12. En este ensayo túbulos individuales se aíslan y la parte distal se coloca en una gota de solución salina, mientras que la parte proximal está abierta. Actividad diurética se calcula midiendo el tamaño de la gotita de orina que se forma en el extremo de la parte proximal. Usando el ensayo de Ramsay, uno puede medir las cantidades de la producción de orina por los distintos tubos de Malpighi. Nuestro ensayo diuresis permite mediciones de las tasas de excreción de todo el mosquito y es, por tanto, no una alternativa al ensayo Ramsay. En su lugar, ambos ensayos pueden proporcionar información complementaria si se usan juntos.
Otros ensayos de excreción in vivo han sido desarrollados para Musca domestica y Aedes aegypti. El M. domestica estudio implicand la medición de la pérdida de agua por un medidor de humedad de flujo a través de 13. Una técnica similar se utilizó para estudiar Aedes aegypti diuresis midiendo las tasas de excreción utilizando una humedad precisión la cámara 14. El ensayo de la diuresis vivo que aquí se presenta no es tan exigente técnicamente como las técnicas antes mencionadas y sin embargo produce datos muy precisos sobre las tasas de excreción en el contexto de un organismo completo.
Existe una amplia gama de aplicaciones futuras para el ensayo de la diuresis in vivo presentados aquí. Además de invertir métodos genética como ARNi puede ser utilizado para estudiar el efecto de los fármacos, por ejemplo inhibidores de transducción de señales, etc, en la diuresis insecto. Es también un ensayo de gran alcance para estudiar el proceso de aclaramiento xenobióticos en insectos diana.
Los problemas que abordaremos mientras el desarrollo de este ensayo son: A) La concentración y la composición del tampón de inyección. Nosotrosutiliza PBS durante los experimentos que realizamos topes hasta ahora, pero otros como el Aedes solución salina fisiológica 15 podría llegar a ser más apropiados para los mosquitos y otros insectos. B) La aplicación de este método a otras especies, especialmente las no-insectos chupadores de sangre. Las cantidades de búfer que puede ser inyectado en estas especies tiene que ser determinada empíricamente para cada especie. C) Reducir al mínimo el error experimental. Vamos a optimizar la inyección y las técnicas de medición.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Victoria Carpintero por sus comentarios críticos de este protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
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