Summary
In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing een
Abstract
Deze video protocol geeft blijk van een effectieve techniek om een bepaald gen in een insect knockdown en voert een nieuwe bioassay om de uitscheiding te meten. Deze methode kan worden gebruikt om een beter begrip van de werkwijze volgens diurèse in insecten verkrijgen en is bijzonder nuttig bij het bestuderen van diurèse in bloed geeft geleedpotigen die kunnen nemen grote hoeveelheden vloeistof in een bloedmaaltijd.
Deze RNAi-gemedieerde gen-knockdown in combinatie met een in vivo diurese test werd ontwikkeld door de Hansen lab om de effecten van RNAi-gemedieerde knockdown van aquaporine genen op Aedes aegypti mug diurese 1 te bestuderen.
Het protocol is ingesteld in twee delen: de eerste demonstratie laat zien hoe een eenvoudige injectie mug apparaat te maken en hoe voor te bereiden en dsRNA te injecteren in de thorax van muggen voor RNAi-gemedieerde gen knockdown. De tweede demonstratie illustreert hoe bepalenuitscheiding prijzen voor muggen met behulp van een in vivo bioassay.
Protocol
Deel I - RNAi-gemedieerde gen knock-down in het volwassenenonderwijs Aedes aegypti muggen. Voor experiment overzicht zie figuur 1.
1. dsRNA Synthese
- Synthetiseren specifieke dsRNA's tegen genen van belang en controle dsRNA's. Opmerking: we raden ontwikkeling primers voor PCR fragmenten in het bereik van 300 tot 500 baseparen gelegen aan het 3 'uiteinde van de specifieke cDNA 2 en het T7 primersequentie bevestigd aan het 5'-uiteinde (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Uniciteit van de fragmenten moet worden bevestigd door BLASTN analyse 3.
- Gebruik de Ambion Megascript T7 High Yield Transcription Kit (Ambion, tafel van reagentia) die T7 RNA-polymerase maakt gebruik van voor de transcriptie reactie op dsRNA te synthetiseren. Opmerking: soortgelijke reagentia en kits zijn beschikbaar elders.
- Om dsRNA te zuiveren, neerslag met lithiumchloride volgens de instructies van de Megascript kit.
- Na purification, ontbinding van de dsRNA pellet in steriel water. Om voldoende viscositeit voor micro-injectie te garanderen, moet de dsRNA concentratie dan 2 pg / pl.
2. Injectie Voorbereiding
- Een eenvoudige micro-injector kunnen worden geconstrueerd met behulp van slangen, een schaar, een metalen naald, een 1 ml spuit, en een 1 ml plastic pipet (zie figuur 2). De slang worden gesneden ~ 40 cm lengte. Als alternatief kan een geautomatiseerde micro-injector worden gebruikt, zoals Drummond Nanojet II 4.
- Snijd de punt van de spuit (naald hub) op 2 ml schaal merkteken uit de rubber zuiger kop van de zuiger.
- Punch een gat met behulp van een metalen naald in de rubber zuiger kop en de plaats van de rubber zuiger hoofd terug in de naald hub.
- Plaats de naaldnaaf in een uiteinde van de buis en plaats van 1 ml plastic pipet het andere uiteinde, die wordt gebruikt als het mondstuk (eventueel een 10 ml syRinge kan worden gebruikt om de druk die nodig zijn voor injectie produceren).
- Plaats een glazen capillair naald in het gat in de rubberen zuiger en breken de punt van de naald uit zodat de breedte groot genoeg is voor vloeistof doorheen kan stromen. Opmerking: De optimale grootte van de naaldpunt te empirisch worden bepaald - als de breedte van de naald te groot zal resulteren in trauma en een hoge sterfte mug Wanneer de wijzer te klein is, zal het onmogelijk te dringen de mug exoskelet.
- Dompel de injectienaald in de voorbereide dsRNA monster en teken de vloeistof monster in de injectienaald door het opzuigen van de vloeistof met het mondstuk (of een spuit). Opmerking: Deze stap is identiek voor alle vloeibare reagentia die geïnjecteerd muskieten, zoals PBS buffer, die in de in vivo analyse diurèse protocol (zie hieronder).
3. Verzamel en Verdoof Muggen
- Collect muggen met een batterij aangedreven aspirator in een verzameling flacon. Plaats een kapje over de collectie flacon en plaats de flacon op een schone CO 2 pad aan muggen verdoven. Opmerking: Als alternatief muggen kunnen verdoofd worden op ijs.
4. Mosquito Injectie
- Open de collectie flacon en plaats de muggen direct op de CO 2-pad en wacht tot muggen zijn verdoofd.
- Gooi alle mannen.
- Dusdanig dat de muggen aan de kant om te zorgen voor een betere toegang voor injectie.
- Pak muggen door de benen of vleugels om letsel te voorkomen. U kunt ook gebruik maken van een fijn penseel of een veer aan muggen te manipuleren.
- Als u klaar bent om de eerste mug injecteren, zachtjes ondersteunen de ene kant van de thorax met de tang en steek de punt van de naald in de andere kant van de thorax (figuur 2). Het is beter te injecteren in een dunne deel van de opperhuid en drukken de naald om te voorkomeno diep in de thorax.
- Zodra de naald op zijn plaats zit, blaas de vloeistof in de mug. De gewenste hoeveelheid kan worden bepaald door bewaking van de vloeistof meniscus in de naald. Het aantal millimeters nodig om een soortelijk volume kan worden bepaald door de cilinder volume van de glazen capillair naald (πr 2 h). De effectieve hoeveelheid van dsRNA die meestal wordt gebruikt voor injectie 1 pg.
- Zodra de vloeistof wordt geïnjecteerd in muggen, terug te trekken voorzichtig de naald. Als een groot druppel vloeistof vormen aan de buitenzijde van de thorax moet de mug worden weggegooid. Vervolgens herhaal dit proces met de volgende mug.
5. Mosquito Herstel en opslag
- Na de injectie, plaats de muggen in een container voor opslag. Bijvoorbeeld, een pint was kartonnen bekers (soep kopjes) bekleed met gaas bekleding bevestigd met de kartonnen deksel. Het deksel heeft een deel geknipt voor het gaas die wordt blootgesteld. Zodra alle mosquitoes geplaatst in de houder plaatsen van de container op een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer voor incubatie en bieden de muggen met een voedingsbron, zoals 20% sucrose geweekt watten bovenop het gaas bekleding. Voor het uitvoeren van de in vivo diurese test, ontnemen de dsRNA-geïnjecteerde muggen van een waterbron voor 12 uur naar de hydratatie toestand van elke mug te standaardiseren.
- De efficiëntie van dsRNA gemedieerde gen knockdown kan variëren. Gene silencing kon beginnen een dag na de injectie en het zou duren tot 6 dagen na de injectie 4. De optimale tijd tot gen knockdown bereiken moet empirisch worden bepaald voor elk gen gebruikt. Over het algemeen, we wachten 3 dagen na de dsRNA injectie voordat we gaan.
Deel II - In vivo assay diurese bij volwassen Aedes aegypti muggen
Let op: Dit protocol is ontwikkeld door de auteurs engebruikt voor de RNAi-gemedieerde knockdown van aquaporine eiwitten in het gele koorts mug Aedes aegypti 1. Om variabiliteit tussen individuele muggen te voorkomen, moet muggen worden geanalyseerd in groepen. Om technische redenen, raden wij aan groepen van 5 muggen per behandeling - er is een beperkte hoeveelheid tijd om de laagste gewichtsklasse meting uit te voeren vóór de muggen beginnen te urine uitscheiden na de injectie.
6. Verzamel en Verdoof Muggen
- Voor het verzamelen van de muggen, neem het gewicht van een lege collectie flacon met een dop met behulp van een analytische precisie balans. Dit flesje wordt gebruikt voor opeenvolgende metingen.
- Verzamel 5 vrouwelijke muggen door de gewogen collectie flacon met een aspirator. Plaats het kapje over het verzamelen flacon en laat het op de CO 2-pad zitten voor een aantal seconden ingedrukt om de muggen te verdoven.
7. Eerste weging
- Neem thij begingewicht meting van de 5 muggen door het plaatsen van de collectie flacon met de muggen met de dop van de precisie balans.
- Bereken het gewicht van de groep 5 muskieten door het gewicht van de muggen en de verzameling flacon met kap en trekken van het gewicht van de lege verzameling flacon cap.
- Open de collectie flacon en plaats de muggen direct op de CO 2-pad na het opnemen van het gewicht van de muggen. Als de muggen beginnen om wakker te worden tijdens het gewicht metingen, stelt u de flacon op de CO 2-pad voor een aantal seconden voordat u deze opent en het plaatsen van de muggen op het pad.
8. Injectie Voorbereiding
- Stel de micro-injector volgens de instructies in de RNAi-gemedieerde gen-knockdown protocol.
- Plaats een glazen capillaire naald in de micro-injector en breek de punt van de naald af, zodat de breedte is groot genoeg voor LIQuid doorheen kan stromen.
- Dompel de naald in PBS-buffer en teken de buffer in de injectienaald, de gewenste hoeveelheid te gebruiken voor dit protocol is 1,25 ul van PBS voor elke mug. Let op: Dit bedrag bootst de gemiddelde hoeveelheid bloedplasma die is genomen door een vrouwelijke mug 5.
9. Mosquito Injectie
- Dusdanig dat de muggen te zorgen voor een betere toegang van de micro-injector.
- Zodra de naald op zijn plaats, blazen PBS-buffer in de mug.
- Als de vloeistof geïnjecteerd wordt in het mug kan een druppel op de buitenzijde van de thorax. Deze druppel moet zorgvuldig worden verwijderd voordat de volgende stap.
- Herhaal deze injectie proces met de volgende mug. Met ervaring, zal bijna 100% mug overlevingskans na injectie.
10. Wegen Muggen
- Na de injectie, plaats voorzichtig de muggen in de collectie flaconen kap. Neem de eerste weging van de 5 muggen door het plaatsen van de collectie flacon met de muggen met de dop van de precisie balans.
- Bereken het gewicht van de groep 5 muskieten door het gewicht van de muggen en de verzameling flacon met kap en aftrekken het gewicht van de lege verzameling flacon cap. Let op: muggen zal beginnen om de urine te scheiden binnen 2 minuten na het verwijderen van de CO 2-verdoving pad, dus is het belangrijk om het gewicht te meten voordat ze beginnen te scheiden.
- Plaats muggen in een klein bakje, waar ze zal beginnen om de urine te scheiden.
11. Tweede en volgende Gewicht Maten
Opmerking: Gewicht metingen van de muggen moeten worden genomen in 30 minuten, maar dit kan aangepast aan kortere of langere tussenpozen, afhankelijk van de uitscheiding tarieven worden.
- Na 30 minuten, het verzamelen van de Group van 5 muggen met een aspirator in dezelfde collectie flacon met dop. Neem de volgende gewicht meting van de muggen door het plaatsen van de collectie flacon met de muggen met de dop van de precisie balans.
- Na de meting, plaats de muggen in hetzelfde bedrijf container voor de volgende 30 minuten.
- Herhaal dit voor een gewenste tijd.
12. Het bepalen van Mosquito excretiesnelheid
- De totale hoeveelheid vloeistof werd geïnjecteerd in de groep van 5 muggen worden berekend door het begingewicht van de muggen het gewicht direct na de injectie.
- De hoeveelheid urine die werd door de groep van muggen uitgescheiden op een bepaald tijdstip kan worden berekend door de initiële gewicht van de muggen van het gewicht van de muggen op de specifieke tijdstip.
- De excretie snelheid op een bepaald tijdstip kan worden berekend door dividing van de hoeveelheid urine uitgescheiden op dit tijdstip door de totale hoeveelheid vloeistof geïnjecteerd (Tabel 1).
13. Representatieve resultaten
RNAi-gemedieerde gen knock-down en in vivo diurese test zijn gebruikt door de Hansen lab om de effecten van aquaporines in Aedes aegypti mug diurese te bestuderen. Drie aquaporines die worden uitgedrukt in Aedes aegypti Malpighi werden neergehaald met een significant effect op de uitscheiding tarieven in vergelijking met muggen een controle te houden. Figuur 4 toont representatieve resultaten van een experiment waar de diurese test is gebruikt om de uitscheiding tarieven te vergelijken tussen Aedes aegypti en Culex quinquefasciatus bij verschillende temperaturen.
Figuur 1. Flowchart van de RNAi / diurese test. 5 groepen van 10 muggen each worden geïnjecteerd met dsRNA voor een specifiek gen en nog eens vijf groepen van tien muggen worden geïnjecteerd met controle dsRNA. Een andere groep muskieten geïnjecteerd met 200 pM HgCl 2 in PBS als positieve controle. Deze muggen zijn gewogen voor injectie, en na de injectie in dertig minuten gedurende 3 uur.
Figuur 2. Een eenvoudige micro-injectie inrichting voor het RNAi-gemedieerde gen knockdown en in vivo diurèse assay. A. De glazen capillair naalden voor injectie. De grijze driehoek staat voor de millimeter stappen getrokken op de naald aan de hoeveelheid vloeistof ingespoten in de mug aan te geven. B. 1 ml spuit gebruikt om de micro injector construeren. De witte driehoek staat voor de naald hub en de zwarte driehoek staat voor de rubber zuiger kop aan de zuiger in de spuit. C. De buis gebruikt om het mondstuk hechten aande verstuiver. D. 1 ml wegwerp pipetpunt (blauw tip) dat wordt gebruikt als de spreekbuis van de micro-injectie apparaat. E. De micro-injectie apparaat dat AD onderdelen zijn verwerkt. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Optimale mug op de injectieplaats. A. Vrouw Aedes aegypti mug geïnjecteerd met een glazen capillaire naald tussen de grote schubben op de thorax. De zwarte balk geeft 1 mm voor maat vergelijking. B. Een tekening van de vrouwelijke mug thorax en de witte vlekken vormen de witte schubben in de mug exoskelet. De injectienaald moet de mug tussen de plekken doorboren om sterfte te minimaliseren tijdens de injectie.
Figuur 4. Effecten van temperatuurtuur op Culex quinquefasciatus en Aedes aegypti diurese. De diurese test werd uitgevoerd met twee soorten muggen, Aedes aegypti en Culex quinquefasciatus, bij verschillende temperaturen. De excretie in het eerste uur na injectie in procenten.
| Groep | TARA (G) | niet geïnjecteerd (G) | na injectie (G) | 1 uur na de injectie (G) | gemiddeld gewicht (mg) | hoeveelheid ingespoten (Pi) | hoeveelheid uitgescheiden (Pi) | % Uitgescheiden |
| 1 | 7,5938 | 7,6057 | 7,6104 | 7,6096 | 2,38 | 0,94 | 0,16 | 17,0 |
| 2 | 7,8252 | 7,8349 | 7,8415 | 7,8403 | 1,94 | 1,32 | 0,24 | 18,2 |
| 3 | 7,8896 | 7,9026 | 7,9077 | 7,906 | 2,6 | 1,02 | 0,34 | 33,3 |
Tabel 1. Aedes aegypti in vivo diurèse testresultaten. Ruwe gegevens van de in vivo diurèse assay uitgevoerd met Aedes aegypti vrouwelijke muggen bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gebruikte RNAi-protocol is ontwikkeld in het laboratorium van Alexander Raikhel aan de Universiteit van Californië Riverside 6,7 en is vergelijkbaar met een protocol gepubliceerd door Garver en Dimopoulos 4. De experimentele benadering in deze video protocol kan worden gebruikt om genen in insect diurèse in een in vivo studie omgeving. De uitscheidingsorganen van insecten, de buisjes van Malpighi, hebben de interesse van de generaties van onderzoekers als een 'simpele' modelsysteem voor de diurese. Dit orgaan houdt zich bezig met xenobiotica klaring 8 en werk in Drosophila heeft talrijke genen die betrokken zijn bij Malpighi tubulus fysiologie 9,10 die nu bestudeerd kan worden in andere insecten, soorten met omgekeerde genetische methoden zoals RNAi. Veel homologe genen kan gemakkelijk worden geïdentificeerd in de gepubliceerde genoomsequenties van verschillende insectensoorten 11. Drie dagen oude muskieten in dit protocol omdat op dit moment point ze bevoegd zijn om een bloedmaaltijd te nemen.
Verschillende andere uitscheiding testen zijn gemeld. De klassieke Ramsay test is gebruikt om de diurese te bestuderen in geïsoleerde Malpighi in vitro 12. In deze assay een buisjes worden geïsoleerd en het distale deel wordt in een druppel zoutoplossing terwijl het proximale deel open is. Diuretische werking wordt berekend door het meten van de urine druppel vormt die aan het einde van het proximale deel. Met behulp van de Ramsay-test, kan men meten hoeveelheden urine productie door individuele buisjes van Malpighi. Onze diurese test kunnen metingen van de hele muggen uitscheiding tarieven en is dus geen alternatief voor de Ramsay-test. In plaats daarvan kunnen beide testen geven aanvullende informatie als ze samen worden gebruikt.
Andere in vivo assays uitscheiding zijn ontwikkeld voor Musca domestica en Aedes aegypti. De M. domestica studie te betrekkend de meting van waterverlies door een doorstroom vochtigheidsmeter 13. Een vergelijkbare techniek werd gebruikt om Aedes aegypti diurèse bestuderen door meting excretiesnelheden met een precisie vochtigheid kamer 14. De in vivo assay diurèse die hier niet zo technische eisen het bovengenoemde technieken en toch maakt zeer nauwkeurige gegevens excretiesnelheden in de context van een volledige organisme.
Er is een groot aantal toekomstige toepassingen voor de in vivo analyse diurèse hier gepresenteerd. Naast genen methoden zoals RNAi keren kan worden gebruikt om de werking van geneesmiddelen te bestuderen, bijvoorbeeld signaaltransductie remmers enz. op insecten diurèse. Het is ook een krachtige test om het proces van xenobiotica klaring te bestuderen in doel insecten.
Problemen die we zullen aanpakken, terwijl de verdere ontwikkeling van deze test zijn: A) De concentratie en samenstelling van de injectie buffer. WijPBS wordt gebruikt voor de experimenten voerden wij tot nu toe, maar andere buffers, zoals Aedes fysiologische zoutoplossing 15 zou kunnen blijken te zijn meer geschikt zijn voor muggen en andere insecten. B) Het toepassen van deze methode om andere soorten, met name niet-bloedzuigende insecten. De hoeveelheid buffer kan worden geïnjecteerd deze soorten is empirisch worden bepaald voor elke soort. C) Minimaliseer experimentele fout. We optimaliseren onze injectie-en meettechnieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Victoria Carpenter voor haar kritische opmerkingen van dit protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion | AM1334 | |
| PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Plastic tubing | Local Supplier | PVC | |
| 1 ml plastic pipette tip | VWR international | 83007-376 | Blue tip |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| Scissors | Local Supplier | ||
| Metal needle | Carolina Biological | 654307 | Size 5 |
| Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
| Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | |
| Glass capillary needles | World Precision Instruments, Inc. | 1B200-6 | |
| Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| One pint waxed lined cardboard cups | Local Supplier | Manufactured soup cups | |
| Mesh net | Local Supplier | plastic fly gauze |
References
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578 (2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination. Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).
- Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
- Clements, A. N. Volume 1 Development, Nutrition, and Reproduction. The Biology of Mosquitoes. 2, Chapman & Hall. London. (1992).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 10626-10631 (2004).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito. The Journal of biological chemistry. 280, 20565-20572 (2005).
- Pannabecker, T. Physiology of the Malpighian Tubule. Annual review of entomology. 40, 493-510 (1995).
- Dow, J. New insights into Malpighian tubule function from functional genomics. Comp Biochem Phys A. 150, S135 (2008).
- Dow, J. A. T. Insights into the Malpighian tubule from functional genomics. Journal of Experimental Biology. 212, 435-445 (2009).
- Lawson, D., et al. VectorBase: a data resource for invertebrate vector genomics. Nucleic acids research. 37, 583-587 (2009).
- Beyenbach, K. W. Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects. J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).
- Coast, G. M. Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis. Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).
- Hays, A. R., Raikhel, A. S. A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes. Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).
