I detta protokoll kombinerar vi RNAi-medierad geners uttryck med en<em> In vivo</em> Diures analys för att studera effekterna knockdown av gener av intresse har på mygg vätskeutsöndringen.
Denna video protokollet visar en effektiv teknik för att knockdown en viss gen i en insekt och genomföra en ny bioassay för att mäta utsöndringshastighet. Denna metod kan användas för att erhålla en bättre förståelse av förfarandet enligt diures hos insekter och är speciellt användbar vid studier av diures i livnär sig på blod artropoder som har förmåga att ta upp stora mängder av vätska i en enda blodmjöl.
Detta RNAi-medierad gen knockdown i kombination med en in vivo-diures analys har utvecklats av Hansen labbet för att studera effekterna av RNAi-medierad knockdown av aquaporin gener på Aedes aegypti mygga diures 1.
Protokollet är inställt i två delar: den första demonstrationen visar hur man konstruerar en enkel anordning mygga injektion och hur man förbereder och injicerar dsRNA i bröstkorgen av myggor för RNAi-medierad gen knockdown. Den andra demonstrationen visar hur man bestämmerutsöndringshastigheter i myggor som använder en in vivo-bioanalys.
Det RNAi protokoll som används har utvecklats i laboratoriet Alexander Raikhel vid University of California Riverside 6,7 och liknar ett protokoll publicerats av Garver och Dimopoulos 4. Den experimentella metoden visad i denna video protokoll kan användas för att studera gener involverade i insekts diures i en in vivo-miljö. Utsöndringsorganen av insekter, de Malpighian tubuli, har väckt intresse hos generationer av forskare som en "enkel" modell för diures. Detta organ ?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Victoria snickare för hennes kritiska kommentarer i detta protokoll.
Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
MEGAscript T7 High Yield Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
PBS buffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Plastic tubing | Local vendor | PVC | |
1 ml plastic pipette tip | VWR | 83007-376 | Blue tip |
1 ml syringe | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
Scissors | Local vendor | ||
Metal needle | Carolina Biologicals | 654307 | Size 5 |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | UPMA Labs | IPMM 2000 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
Glass capillary needles | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Stereo dissection microscope | Leica Microsystems | S6D | |
Analytical precision balance | Mettler Toledo | AB54S | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
One pint waxed lined cardboard cups | Local vendor | Manufactured soup cups | |
Mesh net | Local vendor | plastic fly gauze |