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Ferumoxytol, एक एफडीए स्वीकृत आयरन आक्साइड nanoparticle के साथ स्टेम सेल लेबल

Published: November 4, 2011 doi: 10.3791/3482
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1
1Department of Radiology, Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), 2Stanford School of Medicine, Stanford University

Summary

हम लेबलिंग और एफडीए को मंजूरी दी, superparamagnetic लोहे (SPIO) ऑक्साइड, ferumoxytol (Feraheme) के साथ स्टेम सेल पर नज़र रखने के लिए एक तकनीक का वर्णन. यह सेलुलर इमेजिंग तकनीक है कि दृश्य के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआर) का इस्तेमाल करता है, दीर्घकालिक और रोगियों में सफल हो या असफल स्टेम सेल engraftments की निगरानी और निदान के लिए आसानी से पहुँचा जा सकता है.

Protocol

1. दिवस 1

1) प्लेट कोशिकाओं

  1. एक confluency 80 के% T75 फ्लास्क में प्लेट कम से कम 18-24 घंटे लेबलिंग पहले hMSC. वैकल्पिक जहाजों के लिए अनुदेश के लिए तालिका 1 देखें.

2. 2 दिन

2) लेबलिंग समाधान तैयार करें. यह तैयारी 80 400 μg / Fe मिलीलीटर की एक एकाग्रता के साथ confluency% पर एक (1) T75 फ्लास्क लेबल होगा. वैकल्पिक जहाजों के लिए अनुदेश के लिए तालिका 1 देखें.

  1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में: सीरम स्वतंत्र मीडिया के 1 मिलीग्राम और ferumoxytol के 93.1 μl (30 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक) के मिश्रण से एक समाधान (1 समाधान) बनाएँ.
  2. एक दूसरे 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में: सीरम मुक्त मीडिया और protamine सल्फेट के 7 (10 मिलीग्राम / एमएल शेयर) μl 1 मिलीलीटर का मिश्रण करके एक दूसरे समाधान (2 समाधान) बनाएँ.
  3. प्रत्येक समाधान के 5 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें.
  4. समाधान 1 और 2 के साथ जोड़ें. धीरे नए लेबलिंग समाधान मिश्रण. 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए समाधान USPIO समर्थक अनुमति देंtamine सल्फेट परिसरों फार्म के लिए.
  5. SPIO / 7 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए protamine सल्फेट समाधान के मिश्रित 2 मिलीलीटर सीरम स्वतंत्र मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें.

3) लेबलिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी

  1. कोशिकाओं से मीडिया महाप्राण (व्यंजन).
  2. धीरे कोशिकाओं को एक बार पूर्व गर्म मिलीग्राम / Ca मुक्त डी पीबीएस या सीरम स्वतंत्र मीडिया के 2-3 मिलीलीटर के साथ दूर अवशिष्ट सीरम प्रोटीन और या अन्य मीडिया घटक है कि विपरीत एजेंट तेज और लेबलिंग दक्षता ख़राब कर सकता कुल्ला धो. द्रव कुल्ला महाप्राण (व्यंजन).

4) लेबल कोशिकाओं

  1. कोशिकाओं को हल लेबलिंग का पूरा 7 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. एक इनक्यूबेटर (37 ° C / 5% सीओ 2) और कोशिकाओं को 4 घंटे के लिए लेबलिंग समाधान में सेते करने की अनुमति में प्लेस कोशिकाओं .
  3. कक्षों की लेबलिंग समाधान के लिए FCS के 700 μl 10% के अंतिम सीरम एकाग्रता को प्राप्त करने में जोड़ें. सीरम समृद्ध पर्यावरण की कोशिकाओं के आदी रहे हैं फिर से स्थापित, और मील में सहायता करने के लिए जोड़ा जाता हैकोशिका मृत्यु है कि एक अचानक बदलाव से 24 घंटे एक सीरम मुक्त वातावरण के लिए जोखिम के लिए परिणाम सकता है nimizing.
  4. कोशिकाओं को एक अतिरिक्त 20 घंटे के लिए लेबलिंग समाधान के साथ सेते करने की अनुमति दें.

3. 3 दिन

5) लेबल कोशिकाओं की तैयारी

  1. कोशिकाओं से लेबलिंग समाधान महाप्राण (व्यंजन).
  2. धीरे से पूर्व गर्म मिलीग्राम / Ca मुक्त डी पीबीएस के 2-3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला. बाहर पीबीएस महाप्राण (व्यंजन). यह महत्वपूर्ण है मिलीग्राम / Ca - मुक्त पीबीएस उपयोग के रूप मिलीग्राम और Ca अगले कदम में trypsin की दक्षता ख़राब.
  3. कोशिकाओं को पूर्व गर्म trypsin 0.05% की 2 मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी वापस झुकाव और आगे कुप्पी की पूरी सतह को सुनिश्चित trypsin की एक पतली परत के साथ कवर किया जाता है. एक मशीन (37 ° C / 5% सीओ 2) में कोशिकाओं प्लेस और कोशिकाओं को 5-7 मिनट के लिए या आराम करने के लिए जब तक कोशिकाओं की थाली से अलग शुरू की अनुमति है. यह एक खुर्दबीन के नीचे टुकड़ी की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है. धीरे यदि आवश्यक पिता फ्लास्क पक्ष का दोहनसेल सतह टुकड़ी cilitate.
  4. पूर्व गर्म पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें फ्लास्क trypsin बेअसर. धीरे trypsin / मीडिया / सेल समाधान pipetting ऊपर और नीचे कई बार फ्लास्क कुल्ला. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में संपूर्ण समाधान लीजिए. 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र.
  5. सेल गोली परेशान बिना ध्यान से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). मीडिया के 5 मिलीलीटर (युक्त सीरम या सीरम मुक्त) में कोशिकाओं Resuspend. 5 मिनट के लिए 400 आरसीएफ पर सेल समाधान अपकेंद्रित्र.
  6. सेल 5.5 चरण में वर्णित धोने दोहराएँ. कुल में, कोशिकाओं को तीन बार rinsed होना मीडिया में और कोशिकाओं की सतह पर अवशिष्ट, मुफ्त विपरीत एजेंट निकालने.
  7. इस बिंदु पर कक्षों की गणना के लिए सबसे सही कोशिका गिनती प्राप्त है, के रूप में कोशिकाओं पिछले धोने के दौरान खो जाएगा. कक्षों की व्यवहार्यता परीक्षण प्रदर्शन करना. कक्ष अब कर रहे हैं बाद में विश्लेषण और या प्रयोगात्मक आवेदन के लिए तैयार है. एमआर इमेजिंग T1-w के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है और T2-w पैरामीटर, हालांकि ferumoxytol T2-W विपरीत एजेंट है क्योंकि, ferumoxytol भी T1 प्रभाव दर्शाती है. एमएस 2000-2500 और 60-80 एमएस के एक ते एक टी.आर. के साथ FSE या दृश्यों SE_Multislice: प्रतिनिधि T2-w एमआरआई पैरामीटर है कि छवि ferumoxytol कोशिकाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल हैं. एक T1-W छवि हासिल करने के लिए, ते FSE पर मूल्य या SE_Multislice अनुक्रम में कमी या एक उच्च टी.आर. और कम ते के साथ एक जीआरई अनुक्रम का उपयोग करें. चित्रा 4 लेबल स्टेम सेल इमेजिंग के लिए vivo आवेदन में एक संभावित को दर्शाता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

लेबल की कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण darkening या नकारात्मक टी 2 भारित एमआर छवियों पर विपरीत प्रभाव और brightening या सकारात्मक T1 भारित एमआर छवियों पर विपरीत प्रभाव (चित्रा 2) प्रदर्शित करता है. अनुदैर्ध्य एमआर इमेजिंग और व्यवहार्यता परीक्षण प्रदर्शन 5 दिनों के बाद लेबलिंग कोई महत्वपूर्ण एमआर संकेत और व्यवहार्यता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव unlabeled नियंत्रण (नहीं दिखाया डेटा है) की तुलना में प्रदर्शन किया.

"jove_content> लेबल स्टेम कोशिकाओं बाद में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है या नसों के लिए vivo जांच में इंजेक्शन .

चित्रा 1
चित्रा 1 लोहे के आक्साइड nanoparticle, ferumoxytol के साथ स्टेम सेल की लेबलिंग के लिए योजनाबद्ध समय रेखा.

चित्रा 2
चित्रा 2. बाण के समान कोशिकाओं में एक सेल गोली के साथ पार वर्गों thrrough Eppendorf ट्यूबों के एमआर छवियाँ . ए) नियंत्रण बिना लेबल वाले. बी) लेबल एक महत्वपूर्ण T2 या टी 2 भारित FSE पर नकारात्मक विपरीत एजेंट प्रभाव या SE_Multislice इमेजिंग और T1 भारित जीआरई अनुक्रम पर एक T1 या सकारात्मक विपरीत एजेंट प्रभाव का प्रदर्शन कोशिकाओं.

चित्रा 3
चित्रा 3 सेल pel में कोशिकाओं के साथ बाण के समान पार Eppendorf ट्यूबों के वर्गों.देता है. कम से कम के रूप में 10,000 ferumoxytol लेबल कोशिकाओं टी 2 w एमआर इमेजिंग के माध्यम से पता लगाया जा सकता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. एमआर दृश्य ferumoxytol लेबल स्टेम कोशिकाओं के murine मस्तिष्क ventricles में इंजेक्शन. ए) Axial, एमआर USPIO लेबल स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन के साथ नहीं murine barin छवि. बी), सी Axial) राज्याभिषेक, और टी 2 डी) बाण के समान एमआर छवियों, USPIO लेबल स्टेम कोशिकाओं (सफेद तीर) एक murine मस्तिष्क में इंजेक्शन के नकारात्मक विपरीत प्रभाव चित्रण.

तालिका 1
तालिका 1. वैकल्पिक वाहिकाओं में कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए मात्रा adaptions .

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Discussion

स्टेम सेल engraftments की प्रभावकारिता में सुधार पुनर्योजी चिकित्सा की उन्नति के लिए महत्वपूर्ण है. Vivo में स्टेम कोशिकाओं के लिए एक गैर इनवेसिव दृश्य तकनीक काफी हमारे तंत्र है कि सफल engraftment के परिणामों के लिए नेतृत्व को समझने की क्षमता को बढ़ाता है. एमआर प्रक्रिया हमने दिखा दिया है जैसे दृश्य के लिए चुंबकीय लेबलिंग एमआर इमेजिंग के साथ स्टेम सेल के vivo ट्रैकिंग में की अनुमति देता है . चुंबकीय लेबल स्टेम कोशिकाओं पहले लक्ष्य के ऊतकों में प्रत्यारोपित किया गया है और एमआर इमेजिंग के साथ 7 सप्ताह के लिए visualized किया गया. लंबी अवधि के लेबलिंग और अनुदैर्ध्य इमेजिंग 8 कोशिकाओं के भीतर लोहे के आक्साइड नैनोकणों के lysosomal भंडारण की वजह से संभव है. चुनौतियां, तथापि, लोहा लेबल कोशिकाओं की लंबी अवधि की निगरानी के साथ अनुरूप है. एक लोहे के लेबल की कोशिकाओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के साथ जुड़े चुनौती है कि के रूप में स्वस्थ, व्यवहार्य कोशिकाओं पैदा विपरीत एजेंट daughte वितरितआर कोशिकाओं. बेटी की कोशिकाओं के लिए इसके विपरीत एजेंट का वितरण असमान है और समय पर एक विपरीत एजेंट के रूप में चिह्नित कमजोर पड़ने प्रभाव में परिणाम है. एक दूसरे लोहा लेबल कोशिकाओं के लंबे समय तक निगरानी के साथ जुड़े चुनौती मैक्रोफेज जैसे निवासी phagocytes है कि मूल लेबल, मृत 4 कोशिकाओं से phagocytosed सकता है इसके विपरीत एजेंट जारी, से मूल लेबल, व्यवहार्य कोशिकाओं के बीच फर्क है. हमारे समूह व्यवहार्य और apoptotic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, जो 9-11 ferumoxytol के अलावा अन्य लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ चिह्नित किया गया था की लंबी अवधि के संकेत कैनेटीक्स में मतभेद की पहचान की है . भविष्य के अध्ययन के लिए निर्धारित है कि क्या इन सिद्धांतों को भी ferumoxytol लेबल कोशिका प्रत्यारोपण के लिए लागू करने के लिए आवश्यक हैं.

जबकि इस अध्ययन में संभावित प्रभाव ferumoxytol लेबलिंग स्टेम जांच नहीं किया गया कोशिकाओं के भेदभाव क्षमता पर प्रदर्शन कर सकता है, पिछले अध्ययनों differen पर एक SPIO खुराक निर्भर प्रभाव दिखा दिया हैtiation क्षमता और SPIO खुराक है कि भेदभाव संभावित नहीं क्षीण, सुझाव, एक ferumoxtyol खुराक है कि स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव क्षमता क्षीण नहीं करता है भी 12, 13 निर्धारित किया जा सकता है.

बड़े SPIOs (hydrodynamic व्यास> 50 एनएम) सेल ट्रैकिंग के प्रयोजनों के लिए किया गया है पहले से सरल और जैसे protamine, lipofectin और (पीएलएल) पाली एल lysine 3 electroporation या अभिकर्मक एजेंटों के साथ ऊष्मायन अभिकर्मक सहित विभिन्न लेबलिंग तकनीक के माध्यम से स्टेम सेल लेबलिंग के बाद लागू , 13-16, हालांकि हमेशा SPIOs के साथ सेल लेबलिंग, लेबलिंग के लिए सेल अभिकर्मक विधियों के लिए आवश्यक नहीं है लेबलिंग की सुविधा और लेबलिंग 15 कार्यकुशलता बढ़ाने के लिए फायदेमंद साबित किया है. SPIOs जो सेल लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, तथापि, कोई व्यावसायिक कारणों के लिए उत्पादन किया जा रहा है अब कर रहे हैं. Ferumoxytol जैसे ultrasmall SPIO (USPIO, hydrodynamic व्यास <50 एनएम), दूसरे हाथ पर अभी भी उत्पादित कर रहे हैं जा रहा हैलेकिन एक अभिकर्मक एजेंट की सहायता प्राप्त करने के लिए कुशल सेलुलर तेज 8 की आवश्यकता है. Protamine सल्फेट एक चिकित्सकीय लागू अभिकर्मक एजेंट है कि USPIOs के साथ परिसरों रूपों के लिए 17 स्टेम कोशिकाओं द्वारा विपरीत एजेंट की phagocytic तेज की सुविधा है. के संयोजन एफडीए को मंजूरी दे दी एफडीए को मंजूरी दी USPIO, ferumoxytol के साथ protamine सल्फेट, इस एजेंट के बंद लेबल उपयोग के माध्यम से स्टेम सेल ट्रैकिंग तकनीक के नैदानिक ​​अनुवाद के लिए क्षमता प्रदान करता है है. ध्यान से, ferumoxytol नैदानिक ​​18 परीक्षणों में एक उत्कृष्ट सुरक्षा प्रोफाइल का प्रदर्शन किया है. प्रतिरोपित कोशिकाओं के प्रदर्शन एक जैसे एक तकनीक के माध्यम से प्रत्यक्ष दृश्य कारक है कि को बढ़ावा देने या सफल स्टेम सेल प्रत्यारोपण ख़राब और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए सबसे होनहार तकनीकों की पहचान करने में मदद की एक बेहतर समझ के लिए अनुमति होगी. चिकित्सकीय लागू सेल मार्कर और इमेजिंग उपकरणों के उपयोग के साथ, इस इमेजिंग तकनीक के सिद्धांत में है, आसानी से सुलभरोगियों जो स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण से गुजरना के लिए.

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Disclosures

इस अध्ययन के सभी योगदानकर्ताओं के खुलासे की पेशकश करते हैं.

Acknowledgments

3R01AR054458 02S2: इस काम के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ संधिशोथ और Musculoskeletal और त्वचा रोग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648 Or other base medium for desired stem cell line to be used
D-PBS (Ca++, Mg++ free) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
Trypsin-EDTA 0.05% Invitrogen 25300-120
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03

Ferumoxytol

(Feraheme)

 AMAG 59338-0775-01
Protamine Sulfate APP Pharmaceuticals 22930

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References

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Castaneda, R. T., Khurana, A., Khan, … More

Castaneda, R. T., Khurana, A., Khan, R., Daldrup-Link, H. E. Labeling Stem Cells with Ferumoxytol, an FDA-Approved Iron Oxide Nanoparticle. J. Vis. Exp. (57), e3482, doi:10.3791/3482 (2011).

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