Summary
Vi beskriver en teknikk for merking og sporing stamceller med FDA-godkjent, superparamagnetiske jernoksid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Dette cellular avbildningsteknikk som benytter magnetisk resonans (MR) avbildning for visualisering, er lett tilgjengelig for langsiktig overvåking og diagnostisering av vellykket eller mislykket stamcelleforskningen engraftments hos pasienter.
Abstract
Stamceller basert terapi gi betydelig potensial for feltet av regenerativ medisin. Imidlertid fortsatt mye å bli forstått om in vivo kinetikk av transplanterte celler. En ikke-invasiv metode for å gjentagelser overvåke transplanterte stamceller in vivo ville tillate etterforskere å direkte overvåke stilk cellen transplantasjon, og identifisere vellykket eller mislykket engraftment utfall.
Et bredt spekter av stamceller fortsetter å bli etterforsket for utallige bruksområder. Denne protokollen fokuserer på 3 forskjellige stamcelle populasjoner: humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler, menneskelige stamceller (hMSC) og indusert pluripotent stilk (IPS) celler. HEK 293 celler stammer fra humane embryonale nyre celler dyrket i kultur med skåret adenovirus fem DNA. Disse cellene er mye brukt i forskning fordi de er lett dyrkes, vokser raskt og er lett transfektert. hMSCs finnes i voksen benmarg. Disse cellene can være kopiert som udifferensierte celler samtidig opprettholde multipotency eller potensial til å differensiere i et begrenset antall celle skjebner. hMSCs kan differensiere til linjer av mesenkymale vev, inkludert osteoblaster, adipocytter, chondrocytes, sener, muskler, og marg stroma. iPS celler er genetisk omprogrammeres voksne celler som har blitt modifisert til å uttrykke gener og faktorer lik definere egenskapene til embryonale stamceller. Disse cellene er pluripotent betyr at de har kapasitet til å differensiere i alle celle overleveringslinjer 1. Både hMSCs og iPS celler har vist vev regenerativ kapasitet i-vivo.
Magnetisk resonans (MR) avbildning sammen med bruk av superparamagnetiske jernoksid (SPIO) nanopartikkel cell etiketter har vist seg effektive for in vivo sporing av stamceller på grunn av nærheten mikroskopiske anatomiske oppløsning, tillater en lengre blod halveringstid som langsgående bildebehandling og høy sensitivity for celle påvisning leveres av MR avbildning av SPIO nanopartikler 2-4. I tillegg er MR med bruk av SPIOs klinisk oversettbare. SPIOs er sammensatt av en jernoksid kjerne med dekstran, carboxydextran eller stivelse overflate frakk som tjener til å inneholde bioreactive kjerne av jern fra plasma komponenter. Disse agentene opprette lokale magnetfelt inhomogeneities som fører til en redusert signal på T2-vektet MR-bilder 5. Dessverre er SPIOs ikke lenger blir produsert. Andre generasjon, ultrasmall SPIOs (USPIO), men tilbyr et levedyktig alternativ. Ferumoxytol (FerahemeTM) er en USPIO består av en ikke-støkiometrisk magnetitt kjerne omgitt av en polyglucose sorbitol carboxymethylether pels. Den kolloidale, partikkelstørrelse på ferumoxytol er 17-30 nm som bestemmes av lysspredning. Den molekylære vekten er 750 kDa, og relaksivitet konstant på 2T MR-feltet er 58.609 mM-1 sek-1 styrke fire. Ferumoxytol ble nylig FDA-godkjent ener en jern supplement for behandling av jernmangel hos pasienter med nyresvikt 6. Vår gruppe har anvendt denne agenten i en "off label" bruk for celle merking applikasjoner. Vår teknikk demonstrerer effektiv merking av stamceller med ferumoxytol som fører til betydelige MR signal effekter av merket celler på MR-bilder. Denne teknikken kan brukes for non-invasiv monitorering av stilk cellen terapi i pre-kliniske og kliniske innstillinger.
Protocol
1. Dag 1
1) Plate celler
- Plate hMSC i en T75 kolbe på en confluency på 80% i minst 18-24 timer før merking. Se tabell 1 for instruksjon for alternative fartøy.
2. Dag 2
2) Utarbeide merking løsning. Dette preparatet vil label én (1) T75 kolbe på 80% confluency med en konsentrasjon på 400 mg Fe / ml. Se tabell 1 for instruksjon for alternative fartøy.
- Lag en løsning (løsning 1) ved å blande 1 ml serum-frie medier og 93,1 mL av ferumoxytol (lager: 30 mg / ml) i en 15 ml konisk tube.
- Lag en annen løsning (løsning 2) ved å blande 1 ml serum-frie medier og 7 mL av protamin sulfat (lager: 10 mg / ml) i en andre 15 ml konisk tube.
- La hver løsning til hvile i 5 minutter.
- Legg løsninger 1 og 2 sammen. Bland forsiktig den nye merkingen løsningen. La løsningen for å hvile i 5 minutter å tillate USPIO-protamine sulfat komplekser til form.
- Tilsett 5 ml serum-frie medier til blandede 2 ml SPIO / protamin sulfat-løsning for en endelig volum på 7 ml.
3) Forbered celler for merking
- Aspirer media fra cellene.
- Forsiktig vaske cellene gang med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-free D-PBS eller serum-free media for å skylle bort rester av serum proteiner og eller andre medier komponenter som kan svekke kontrastmiddel opptak og merking effektivitet. Aspirer ut skyll væske.
4) Etikett celler
- Legg hele 7 ml av merking løsning på celler.
- Plasser cellene inn i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) og la cellene å ruge på etiketten løsningen for 4 timer.
- Legg til 700 mL av FCS til merking løsning av cellene for å oppnå en endelig serumkonsentrasjon på 10%. Serum er lagt til re-etablere beriket miljøet der cellene er vant til, og å bistå i minimizing celledød som kan resultere fra en brå skift til 24 timers eksponering til en serum-fritt miljø.
- La cellene til å ruge med merking løsningen for ytterligere 20 timer.
3. Dag 3
5) Utarbeide merkede celler
- Aspirer merking løsning fra celler.
- Forsiktig skylle celler med 2-3 ml forvarmet Mg / Ca-free D-PBS. Aspirer ut PBS. Det er viktig å bruke Mg / Ca-free PBS som Mg og Ca vil svekke effektiviteten av Trypsin i neste trinn.
- Tilsett 2 ml forvarmet 0.05% Trypsin til cellene og vippe flasken frem og tilbake for å sikre at hele overflaten av kolbe er dekket med et tynt lag av Trypsin. Plasser cellene i en inkubator (37 ° C / 5% CO 2) og la cellene hvile i 5-7 minutter eller til cellene begynner å løsne fra platen. Det kan være nødvendig å bekrefte avløsning under et mikroskop. Banke forsiktig på sidene av kolbe om nødvendig for å facilitate celle-overflate avløsning.
- Tilsett 4 ml forvarmet komplett media i kolben for å nøytralisere Trypsin. Forsiktig skylle flasken ved pipettering i Trypsin / media / celle-løsning opp og ned flere ganger. Samle hele løsningen i en 15 ml konisk tube. Sentrifuger cellen løsningen på 400 RCF i 5 minutter.
- Nøye aspirer supernatanten uten å forstyrre cellen pellet. Suspender cellene i 5 ml av media (serum som inneholder eller serum-fri). Sentrifuger cellen løsningen på 400 RCF i 5 minutter.
- Gjenta cellen vaske beskrevet i trinn 5.5. I sum vil cellene skylles tre ganger for å fjerne rester, gratis kontrastmiddel i media og på overflaten av cellene.
- Telle celler på dette punktet for å oppnå den mest nøyaktige celletall, som celler vil gå tapt i løpet av forrige vask. Utfør en levedyktighet test av celler. Cellene er nå klar for senere analyse og eller eksperimentell søknad. MR kan utføres med T1-w og T2-w parametre, fordi selv om ferumoxytol er en T2-w kontrastmiddel, ferumoxytol også utstillinger T1 effekter. Representant T2-w MRI parametre som kan brukes til bilde ferumoxytol merkede cellene inkluderer: FSE eller SE_Multislice sekvenser med en TR på 2000-2500 ms og en TE av 60-80 ms. For å få en T1-w image, redusere TE verdi på en FSE eller SE_Multislice sekvens eller bruke en GRE sekvens med høy TR og lav TE. Figur 4 viser et potensial in vivo søknad merket stamcelleforskningen imaging.
Fire. Representant Resultater:
Merkede celler viser en betydelig mørkere eller negativ kontrast effekt på T2-vektet MR-bilder og en lysere eller positiv kontrast effekt på T1-vektet MR-bilder (figur 2). Langsgående MR avbildning og levedyktighet tester utført fem dager etter merking viste ingen signifikant MR signal og ingen signifikant innvirkning på levedyktighet i forhold til umerkede kontroller (data ikke vist).
jove_content "> Merket stamceller kan i ettertid være differensiert i ulike celletyper eller intravenøst injisert for in vivo undersøkelse.
Figur 1. Skjematisk tidslinje for merking stamceller med jernoksid nanopartikler, ferumoxytol.
Figur 2. MR-bilder av sagittal tverrsnitt thrrough Eppendorf-rør med celler i en celle pellet. A) Umerket kontroller. B) Merket celler demonstrere en signifikant T2 eller negativt kontrastmiddel effekt på T2-vektet FSE eller SE_Multislice bildebehandling og en T1 eller positiv kontrastmiddel effekt på T1-vektede GRE sekvens.
Figur 3. Sagittal tverrsnitt av Eppendorf rør med celler i celle Pellar. Så lite som 10.000 ferumoxytol merkede celler kan oppdages via T2-w MR imaging.
Figur 4. MR visualisering av ferumoxytol-merket stamceller injiseres i murine cerebrale ventriklene. A) Aksial, MR bilde av murine Barin uten injeksjon av USPIO-merket stamceller. B) Aksial, C) koronale og D) sagittal MR bilder skildrer T2, negativ kontrast effekt av USPIO-merket stamceller (hvite piler) injiseres i en murine hjernen.
Tabell 1. Quantity tilpasninger for merking av celler i alternative fartøy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bedre effekt av stamcelleforskningen engraftments er kritisk for fremme av regenerativ medisin. En ikke-invasiv visualisering teknikk for stamceller in vivo øker betydelig vår evne til å forstå mekanismene som fører til vellykkede engraftment utfall. Magnetisk merking for MR visualisering, slik som prosedyren vi har vist, gjør in vivo sporing av stamceller med MR imaging. Magnetisk merkede stamceller har tidligere blitt transplantert inn i target vev og har blitt visualisert opp til uker med MR 7. Langsiktig merking og langsgående bildediagnostikk er mulig på grunn av lysosomal oppbevaring av jernoksid nanopartikler i cellene 8. Utfordringer, men stemmer overens med langsiktig overvåking av jern merkede celler. En utfordring forbundet med langsgående avbildning av jern merket celler er at så sunne, levedyktige celler sprer kontrastmiddelet er distribuert til daughter celler. Fordeling av kontrastmiddelet til datteren celler er ujevn og resulterer i en markant utvanning av kontrastmiddel over tid. En annen utfordring forbundet med langsiktig overvåking av jern merkede cellene er å skille mellom opprinnelig merket, levedyktige celler fra bosatt fagocytter, slik som makrofager, som kan ha phagocytosed sluppet kontrastmiddel fra opprinnelig merket, døde celler fire. Vår gruppe har identifisert forskjeller i langsiktig signal kinetikk av levedyktige og apoptotiske stamcelle transplantasjon, som hadde vært merket med jernoksid nanopartikler annet enn ferumoxytol 9-11. Fremtidige studier er nødvendig for å fastslå hvorvidt disse prinsippene gjelder også ferumoxytol-merket celle transplantasjon.
Selv i denne studien de potensielle effektene ferumoxytol merking kunne utstilling om differensiering kapasiteten av stamceller ble ikke undersøkt, har tidligere studier vist en SPIO doseavhengig effekt på forskjellertiation kapasitet og SPIO doser som ikke svekker differensiering potensial, foreslå en ferumoxtyol dose som ikke svekker differensieringen kapasitet på stamceller kan også bestemmes 12, 13.
Stor SPIOs (hydrodynamisk diameter> 50 nm) har vært anvendt tidligere for celle sporing følgende stamcelle merking via ulike merking teknikker inkludert enkle inkubering og transfeksjon med electroporation eller transfeksjon agenter som protamin, lipofectin og poly-L-lysin (PLL) 3 , 13-16., men ikke alltid nødvendig for celle merking med SPIOs, transfeksjon metoder for celle merking har vist seg gunstig for tilrettelegging for merking og økt merking effektivitet 15. SPIOs som har vært brukt til celle merking, men er ikke lenger blir produsert av kommersielle grunner. Ultrasmall SPIO (USPIO, hydrodynamisk diameter <50 nm) som ferumoxytol, er derimot fortsatt blir produsertmen krever hjelp av en transfeksjon middel for å oppnå effektiv cellulære opptaket 8. Protamin sulfat er en klinisk anvendelig transfeksjon agent som danner komplekser med USPIOs å lette phagocytic opptaket av kontrastmiddelet av stamceller 17. Kombinasjonen av FDA-godkjente protamin sulfat med FDA-godkjente USPIO, ferumoxytol, gir mulighet for klinisk oversettelse av stamcelleforskningen sporing teknikker via off-label bruk av denne agenten. Av notatet, har ferumoxytol vist en utmerket sikkerhetsprofil i kliniske studier 18. Direkte visualisering av det transplanterte cellene via en teknikk som den som demonstrerte ville tillate for en bedre forståelse av hvilke faktorer som fremmer eller forringe vellykket stamceller transplantasjoner og bidra til å identifisere de mest lovende teknikkene for kliniske applikasjoner. Med bruk av klinisk gjeldende celle markører og bildebehandling utstyr er dette avbildningsteknikk i prinsippet lett tilgjengeligtil pasienter som gjennomgår stamcelle transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle bidragsytere til denne studien gir ingen avsløringer.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institute of leddgikt og muskel og hudsykdommer: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
- Narsinh, K. H., Plews, J., Wu, J. C. Comparison of human induced pluripotent and embryonic stem cells: fraternal or identical twins? Mol Ther. 19, 635-638 (2011).
- Bulte, J. W. In vivo MRI cell tracking: clinical studies. AJR. Am. J. Roentgenol. 193, 314-325 (2009).
- Henning, T. D., Boddington, S., Daldrup-Link, H. E. Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging. J. Vis. Exp. (13), e685-e685 (2008).
- Tallheden, T., Nannmark, U., Lorentzon, M. In vivo MR imaging of magnetically labeled human embryonic stem cells. Life. Sci. 79, 999-1006 (2006).
- Jung, C. W., Jacobs, P. Physical and chemical properties of superparamagnetic iron oxide MR contrast agents: ferumoxides, ferumoxtran, ferumoxsil. Magn. Reson. Imaging. 13, 661-674 (1995).
- Coyne, D. W. Ferumoxytol for treatment of iron deficiency anemia in patients with chronic kidney disease. Expert. Opin. Pharmacother. 10, 2563-2568 (2009).
- Li, Z., Suzuki, Y., Huang, M. Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects. Stem Cells. 26, 864-873 (2008).
- Metz, S., Bonaterra, G., Rudelius, M. Capacity of human monocytes to phagocytose approved iron oxide MR contrast agents in vitro. Eur. Radiol. 14, 1851-1858 (2004).
- Nedopil, A., Klenk, C., Kim, C. MR signal characteristics of viable and apoptotic human mesenchymal stem cells in matrix-associated stem cell implants for treatment of osteoarthritis. Invest. Radiol. 45, 634-640 (2010).
- Kraitchman, D. L., Heldman, A. W., Atalar, E. In vivo magnetic resonance imaging of mesenchymal stem cells in myocardial infarction. Circulation. 107, 2290-2293 (2003).
- Stuckey, D. J., Carr, C. A., Martin-Rendon, E. Iron particles for noninvasive monitoring of bone marrow stromal cell engraftment into, and isolation of viable engrafted donor cells from, the heart. Stem Cells. 24, 1968-1975 (2006).
- Henning, T. D., Sutton, E. J., Kim, A. The influence of ferucarbotran on the chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Contrast. Media. Mol. Imaging. 4, 165-173 (2009).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Kalish, H. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Nedopil, A. J., Mandrussow, L. G., Daldrup-Link, H. E. Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects. J. Vis. Exp. (38), e1793-e1793 (2010).
- Arbab, A. S., Yocum, G. T., Wilson, L. B. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Mol Imaging. 3, 24-32 (2004).
- Babic, M., Horak, D., Trchova, M. Poly(L-lysine)-modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjug Chem. 19, 740-750 (2008).
- Golovko, D. M., T, H. enning, Bauer, J. S. Accelerated stem cell labeling with ferucarbotran and protamine. Eur. Radiol. 20, 640-648 (2010).
- Lu, M., Cohen, M. H., Rieves, D. FDA report: Ferumoxytol for intravenous iron therapy in adult patients with chronic kidney disease. Am. J. Hematol. 85, 315-319 (2010).
