Summary
Nós descrevemos uma técnica para rotulagem e rastreamento de células-tronco com FDA-approved, óxido de ferro superparamagnético (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagem celular que utiliza a ressonância magnética (RM) para visualização, é facilmente acessível a longo prazo de monitoramento e diagnóstico de engraftments tronco bem ou mal sucedidas de células em pacientes.
Abstract
Terapias com células-tronco com base oferecem um potencial significativo para o campo da medicina regenerativa. No entanto, ainda há muito a ser entendido em relação ao vivo na cinética das células transplantadas. Um método não-invasivo para monitorar repetidamente células-tronco transplantadas in vivo permitiria que investigadores monitorar diretamente os transplantes de células-tronco e identificar resultados pega bem ou mal sucedidas.
Uma ampla gama de células-tronco continua a ser investigada para inúmeras aplicações. Este protocolo centra-se em três populações de células-tronco diferentes: rim embrionário humano 293 (HEK293) células, as células-tronco mesenquimais (hMSC) e tronco pluripotentes induzidas (iPS) células. HEK 293 células são derivadas de células embrionárias do rim cresceram em cultura com sheared DNA do adenovírus 5. Estas células são amplamente utilizados nas pesquisas, pois são facilmente cultivadas, crescem rapidamente e são facilmente transfectadas. hMSCs são encontradas na medula adulta. Estas células can ser replicado como células indiferenciadas, mantendo multipotency ou o potencial de se diferenciar em um número limitado de destinos celular. hMSCs pode diferenciar a linhagens de tecidos mesenquimais, incluindo osteoblastos, adipócitos, condrócitos, tendão, músculo e estroma da medula. As células iPS são células adultas reprogramadas geneticamente que foram modificados para expressar genes e fatores semelhantes às propriedades definidoras das células-tronco embrionárias. Estas células são pluripotentes significado que eles têm a capacidade de se diferenciar em todas as linhagens de células 1. Ambos hMSCs e células iPS têm demonstrado capacidade regenerativa dos tecidos in vivo.
A ressonância magnética (RM), juntamente com o uso de óxido de ferro superparamagnético (SPIO) rótulos de células de nanopartículas têm se mostrado eficazes no controle in vivo de células-tronco devido à resolução anatômica perto microscópica, um sangue mais meia-vida, que permite imagens longitudinal e sensitivit altay para a detecção de células fornecido por ressonância magnética de nanopartículas SPIO 2-4. Além disso, a RM com o uso de SPIOs é clinicamente traduzíveis. SPIOs são compostos de um núcleo de óxido de ferro com um revestimento superficial dextran, carboxydextran ou amido que serve para conter o núcleo de ferro a partir de componentes bioreactive plasma. Estes agentes locais criar inomogeneidades do campo magnético que levam a uma diminuição do sinal em imagens de T2-weighted MR 5. Infelizmente, SPIOs não são mais fabricados. De segunda geração, ultrasmall SPIOs (USPIO), no entanto, oferecer uma alternativa viável. Ferumoxytol (FerahemeTM) é uma USPIO composto por um núcleo de magnetita não estequiométrica rodeado por uma camada carboxymethylether polyglucose sorbitol. O tamanho coloidal de partículas de 17-30 nm ferumoxytol é determinado por espalhamento de luz. O peso molecular é 750 kDa, ea relaxação constante em 2T campo MRI é 58,609 mM-1 sec-1 de força 4. Ferumoxytol foi recentemente aprovado pelo FDA ums um suplemento de ferro para o tratamento da deficiência de ferro em pacientes com insuficiência renal 6. Nosso grupo tem aplicado este agente em um "off label" uso para aplicações de etiquetagem celular. Nossa técnica demonstra rotulagem eficiente de células-tronco com ferumoxytol que leva a um impacto significativo no sinal MR de células marcadas em imagens de RM. Esta técnica pode ser aplicada para não-invasivos de monitoramento de terapias com células-tronco em ambientes pré-clínicos e clínicos.
Protocol
1. 1 dia
1) Placa de células
- HMSC placa em um frasco T75 em uma confluência de 80%, no mínimo, 18-24 horas antes da rotulagem. Consulte a Tabela 1 para a instrução para os navios alternativo.
2. Dia 2
2) Prepare solução de rotulagem. Esta preparação vai rotular um (1) T75 frasco a 80% confluência com uma concentração de 400 mcg Fe / ml. Consulte a Tabela 1 para a instrução para os navios alternativo.
- Criar uma solução (solução 1) através da mistura de 1 ml de soro livre de media e 93,1 mL de ferumoxytol (stock: 30 mg / ml) em um tubo de 15 ml.
- Criar uma segunda solução (solução 2) através da mistura de 1 ml de soro livre de media e 7 mL de sulfato de protamina (stock: 10 mg / ml) em um tubo de 15 ml segundo cônico.
- Permitir que cada solução em repouso por 5 minutos.
- Adicionar soluções 1 e 2 juntos. Misture suavemente a solução de etiquetagem. Permitir que a solução descansar por 5 minutos para permitir USPIO pro-complexos sulfato de histamina a se formar.
- Adicionar 5 ml de soro livre de mídia para o 2 ml misto de SPIO / solução de sulfato de protamina para um volume final de 7 ml.
3) Prepare células de rotulagem
- Aspirar a mídia a partir de células.
- Lavar cuidadosamente as células uma vez com 2-3 ml de pré-aquecido Mg / Ca-livre D-PBS ou soro livre de mídia para enxaguar residual proteínas séricas e ou outros componentes de mídia que possam prejudicar a captação de contraste e eficiência rotulagem. Aspirar o líquido de lavagem.
4) células Etiqueta
- Adicione a 7 ml solução completa de rotulagem para as células.
- Células lugar em uma incubadora (37 ° C / 5% CO 2) e permitir que as células para incubar na solução de rotulagem para 4 horas.
- Adicionar 700 mL da FCS para a solução rotulagem das células para alcançar uma concentração final de soro de 10%. O soro é adicionado ao re-estabelecer o ambiente enriquecido do qual as células estão acostumados, e para ajudar na minimizing morte celular que poderia resultar de uma mudança abrupta para 24 horas de exposição a um ambiente sem soro.
- Permitir que as células para incubar com a solução de etiquetagem por mais 20 horas.
3. Dia 3
5) Prepare células marcadas
- Aspirar a solução de rotulagem a partir de células.
- Lave as células com 2-3 ml de pré-aquecido Mg / Ca-livre D-PBS. Aspirar o PBS. É importante o uso de Mg / Ca-free PBS como o Mg e Ca irá prejudicar a eficiência de Tripsina na próxima etapa.
- Adicionar 2 ml de pré-aquecido tripsina 0,05% para as células e incline o frasco para trás e para garantir toda a superfície do recipiente é coberta com uma fina camada de Tripsina. Coloque as células em uma incubadora (37 ° C / 5% CO 2) e permitir que as células em repouso por 5-7 minutos ou até que as células começam a se destacar do prato. Pode ser necessário para confirmar o desapego sob um microscópio. Bata suavemente nas laterais do balão se necessário, para facilitar superfície celular desapego.
- Adicionar 4 ml de pré-aquecido mídia completa para o frasco para neutralizar a tripsina. Gentilmente lavar o balão por pipetagem do Tripsina / media / solução célula para cima e para baixo várias vezes. Recolher toda a solução em um tubo de 15 ml. Centrifugar a solução de célula a 400 RCF por 5 minutos.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 5 ml de mídia (soro contendo ou soro-free). Centrifugar a solução de célula a 400 RCF por 5 minutos.
- Repita a lavagem das células descrito no passo 5.5. No total, as células serão lavadas três vezes para remover residual, agente de contraste livre na mídia e na superfície de células.
- Contagem de células neste momento para atingir a contagem de células mais precisos, como as células serão perdidos durante a lavagem anterior. Realizar um teste de viabilidade das células. Células estão agora prontos para posterior análise e ou aplicação experimental. RM pode ser realizada com T1-w e T2-w parâmetros, porque embora ferumoxytol é um agente de contraste T2-w, ferumoxytol também apresenta efeitos T1. Parâmetros representativos T2-w ressonância magnética que pode ser usado para a imagem ferumoxytol células marcadas incluem: FSE ou SE_Multislice seqüências com TR de 2000-2500 ms e um TE de 60-80 ms. Para adquirir uma imagem de T1-w, diminuir o valor do TE em uma seqüência FSE ou SE_Multislice ou usar uma seqüência GRE com uma TR de alta e baixa TE. A Figura 4 demonstra um potencial de aplicação vivo para imagens rotuladas com células-tronco.
4. Resultados representativos:
Células marcadas demonstrar um efeito de contraste significativo escurecimento ou negativos em imagens T2-weighted MR e um efeito de contraste brilho ou positivo em imagens T1-weighted MR (Figura 2). Longitudinal ressonância magnética e testes de viabilidade realizados cinco dias de pós rotulagem demonstrou nenhum sinal de MR significativo e nenhum impacto significativo sobre a viabilidade em comparação com controles não identificados (dados não mostrados).
jove_content "> células-tronco identificadas posteriormente pode ser diferenciada em vários tipos celulares ou por via intravenosa injetada na investigação vivo.
Figura 1. Linha do tempo Esquema de rotulagem células-tronco com nanopartículas de óxido de ferro, ferumoxytol.
Figura 2. As imagens de RM de secções sagitais thrrough eppendorf tubos com células em um pellet celular. A) Unlabeled controles. B) As células identificadas demonstrando uma significativa T2 ou efeito negativo agente de contraste em T2 FSE ou SE_Multislice de imagem e um efeito positivo ou T1 agente de contraste na seqüência GRE ponderada em T1.
Figura 3. Sagital seções de tubos de eppendorf com as células de pel celularpermite. Tão pouco quanto 10.000 ferumoxytol células marcadas podem ser detectadas através de ressonância magnética T2-w.
Figura 4. MR visualização de ferumoxytol marcado com células-tronco injetadas em camundongos ventrículos cerebrais. A) axial, imagem de MR barin murino sem injeção de USPIO marcado com células-tronco. B) axial, C) coronal, e D) imagens sagitais MR retratando o T2, efeito de contraste negativo de USPIO marcado com células-tronco (setas brancas) injetado em um cérebro de camundongos.
Adaptações tabela 1. Quantidade de rotulagem células nos vasos alternativo.
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Discussion
Melhorar a eficácia da engraftments células-tronco é fundamental para o avanço da medicina regenerativa. A técnica de visualização não invasiva de células-tronco in vivo aumenta significativamente nossa capacidade de compreender os mecanismos que levam a resultados enxerto bem-sucedido. Rotulagem magnética para MR de visualização, como o procedimento que temos demonstrado, permite que no acompanhamento in vivo de células-tronco com ressonância magnética. Células-tronco magneticamente rotulada tenham sido previamente transplantadas em tecidos-alvo e foram visualizados até semanas com RM 7. Longo prazo rotulagem e imagem longitudinal é possível devido ao depósito lisossômico das nanopartículas de óxido de ferro dentro das células 8. Desafios, no entanto, não correspondem com o monitoramento a longo prazo de células marcadas de ferro. Um dos desafios associados com a imagem longitudinal de ferro células marcadas é que o mais saudável, as células viáveis proliferar o agente de contraste é distribuído para daughter células. Distribuição do agente de contraste para as células filhas é desigual e resulta em um efeito de diluição acentuada do agente de contraste ao longo do tempo. Um segundo desafio associado com o monitoramento a longo prazo de células marcadas de ferro é a diferenciação entre originalmente rotulados, células viáveis de fagócitos residentes, como macrófagos, que podem ter fagocitado lançado agente de contraste de originalmente rotulados, células mortas 4. Nosso grupo identificou diferenças na cinética de longo prazo do sinal de transplantes de células tronco viáveis e apoptose celular, que haviam sido marcadas com nanopartículas de óxido de ferro que não ferumoxytol 9-11. Estudos futuros são necessários para determinar se esses princípios se aplicam também aos transplantes ferumoxytol marcado celular.
Enquanto neste estudo a rotulagem ferumoxytol potenciais efeitos poderiam exposição sobre a capacidade de diferenciação de células-tronco não foi examinada, estudos anteriores têm demonstrado um efeito dose-dependente SPIO differencapacidade de diferenciação e doses SPIO que não prejudiquem potencial de diferenciação, sugerindo, uma dose ferumoxtyol que não prejudica a capacidade de diferenciação de células-tronco também pode ser determinado 12, 13.
SPIOs grande (diâmetro hidrodinâmico> 50 nm) foram aplicadas anteriormente para fins de rastreamento de células seguintes rotulagem de células-tronco através de técnicas diversas, incluindo a rotulagem de incubação simples e transfecção com eletroporação ou transfecção agentes como protamina, lipofectin e poli-L-lisina (PLL) 3 , 13-16., Embora não seja sempre necessário para a rotulagem de células com SPIOs, métodos de transfecção para a rotulagem de células provaram benéficos para facilitar a rotulagem e aumentar a eficiência rotulagem 15. SPIOs que têm sido utilizados para a rotulagem de células, no entanto, não estão mais sendo produzidos por razões comerciais. Ultrasmall SPIO (USPIO, diâmetro hidrodinâmico <50 nm) tais como ferumoxytol, por outro lado, ainda estão sendo produzidasmas requerem a ajuda de um agente de transfecção para conseguir a captação celular eficiente 8. Sulfato de protamina é um agente de transfecção clinicamente aplicável, que forma complexos com USPIOs para facilitar a captação fagocitária do agente de contraste por células-tronco 17. A combinação da FDA-approved sulfato de protamina com o USPIO FDA-approved, ferumoxytol, oferece o potencial para a tradução clínica de técnicas de rastreamento de células-tronco por meio de uso off-label deste agente. De nota, ferumoxytol tem demonstrado um excelente perfil de segurança em ensaios clínicos 18. Visualização direta das células transplantadas através de uma técnica como a que demonstrou permitiria uma melhor compreensão dos fatores que promovem ou prejudicar a transplantes de células-tronco de sucesso e ajudar a identificar as técnicas mais promissoras para aplicações clínicas. Com o uso de marcadores de células clinicamente aplicáveis e equipamentos de imagem, esta técnica de imagem é, em princípio, facilmente acessíveisaos pacientes que se submetem a transplantes de células-tronco.
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Disclosures
Todos os colaboradores deste estudo não oferecem divulgações.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculosqueléticas e da Pele: 3R01AR054458-02S2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
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