Summary
Combinazione di co-genomica, analisi di espressione genica e l'identificazione di composti bersaglio per via metabolica dare annotazione funzionale del gene.
Abstract
Dato il numero sempre crescente di specie vegetali modello per il quale sequenze genomiche complete sono disponibili e l'abbondanza delle risorse biologiche quali mutanti knockout, le adesioni e le popolazioni selvatiche di riproduzione avanzate, vi è un peso crescente per l'annotazione gene funzionale. In questo protocollo, l'annotazione della funzione dell'impianto gene usando combinato co-analisi di espressione genica, metabolomica e informatica è fornito (Figura 1). Questo approccio si basa sulla teoria di usando geni bersaglio di funzione nota per consentire l'identificazione di geni non annotate probabilità di essere coinvolti in un processo metabolico certa, con l'identificazione di composti bersaglio tramite metabolomica. Le strategie vengono proposti per l'applicazione di queste informazioni sulle popolazioni generati da entrambi gli approcci in avanti e genetica inversa, nonostante nessuno di questi sono senza sforzo. Con corollario questo approccio può anche essere utilizzato come un approccio per caratterizzare picchi sconosciuti rappresentano nuova o specifica sedario metaboliti nei tessuti limitate, specie vegetali o di trattamento dello stress, che è attualmente il processo importante per capire il metabolismo delle piante.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Materiali vegetali vengono raccolte e immediatamente congelati.
- Materiali vegetali sono congelati in polvere da mulino miscelatore (o malta) e conservati in provetta Falcon o tubo Eppendorf a -80 ° C.
2. Estrazione per Profiling Metabolite
- Aliquotare congelati materiale vegetale in una provetta Eppendorf da 2 ml.
- Aggiungere 5 microlitri di tampone di estrazione per milligrammo di peso fresco di materiale vegetale congelato.
- Aggiungi un metallo (o gilconia) palla e omogeneizzare di polvere congelata con il vibromulino per 2 min a 25 ls -1.
- Centrifugare 10 min a 12.000 rpm.
- Trasferire il supernatante in NANOSEP filtro centrifugo.
- Centrifugare 2 min a 4.000 giri.
- Trasferire il surnatante nuovo tubo Eppendorf, e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
3. Profiling metabolita della LC-MS
- Impostare HPLC e controllare la temperatura del forno a colonna e vassoio campione.
- Impostare condizioni di MS e verificare lo stato di vuoto e riscaldamento capillare.
- Eseguire m / z calibrazione del rivelatore MS.
- Trasferire di 50 microlitri di estratti di fiala di vetro per LC-MS.
- Iniettare 5 pl di estratti di LC-MS.
4. Analisi dei dati
- Configurare Xcalibur o Metalign 4 e selezionare l'analisi dei dati da elaborare.
- Elaborare una tabella di picchi rilevati di tuo interesse in accordo con la classe composto in tabella I.
- Identificare i picchi di co-eluizione dei composti standard.
- Annotate rilevato picchi che utilizzano MS 2 analisi, studio della letteratura, ricerca del database metabolita (Figura 2, 12,13).
5. Previsione della via metabolica
- Costruire un percorso possibile con i composti rilevati. Previsione di percorso usando le annotazioni di punta dovrebbe essere basato sulla struttura chimica del composto rilevatos prevedendo il collegamento funzioni enzimatiche sulla via metabolica 13. Passaggi biosintetici Strutturare dovrebbe essere condotta con annotazione di picco preciso. Ma la determinazione della struttura chimica dettagliata, ad esempio zucchero parte, non è indispensabile in questa fase, perché la previsione di residuo di zucchero e posizione addotto è molto difficile identificare mediante analisi MS. Determinazione del tipo di zucchero come hexoside e pentoside saranno identificati mediante saggio enzimatico donatore di zucchero al ultima fase di progetto. Per lo più la costruzione di previsione del percorso deve essere eseguita come piccola molecola è intermedia di un più ampio molecola salvo nei taluni casi, come reazione di disidratazione. Elenco di peso atomico molecolare, per esempio 16 m / z per differenza tra-H e-OH frazione (ossidazione), 14 m / z (atomo di carbonio) per la differenza tra-OH e-OMe (metilazione) e 162 m / z ( MW-H 2 O) per esosi (glicosilazione), è utile per la previsione. Determinazionetipo di modifica con l'analisi di correlazione delle specificità dei tessuti aiuta previsione di via metabolica. Database del percorso metabolico generale come ad esempio database KEGG ( http://www.genome.jp/kegg/ ) e PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), è molto efficace per la previsione della via metabolica di tuo interesse.
6. Preparazione della lista con Gene ID Gene Arabidopsis ortologhe
- Download ID elenco gene dal database genomico.
- Aggiungi ID Arabidopsis gene del gene ortologhe, in caso di vostro impianto di destinazione non è Arabidopsis.
- Preparare una lista di geni nel pathway di interessi. Annotazione dei dati pathway di Arabidopsis e dati famiglia genica sono disponibili nel sito TAIR ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Se avete preparato un elenco di Arabidopsis geni ortologhi, è possibile successivamente combiNE loro.
7. Co-ha espresso l'analisi del gene
- Prova utilizzando l'elenco preparato ID gene per cercare miglior database per il vostro percorso controllando la correlazione con coppie di geni ben noti nel percorso d'interesse (tabella II). Se la co-espressione database o l'espressione del gene del database non sono disponibili nello stabilimento di vostro interesse, Arabidopsis co-espressione del database deve essere utilizzato con una lista di geni ortologhi di Arabidopsis. In caso di orzo, riso, pioppo, frumento, Medicago e soia, co-espressione analisi di specie di piante possono essere utilizzati (Tabella II).
- Costruire il quadro di riferimento per il vostro obiettivo co-espressione di rete basata sulle connessioni dei ben noti geni nel pathway di interessi.
- Aggiungi geni candidati correlati (r <0,4 ~ 0,90, nel valore approssimativo del valore del coefficiente fra le connessioni dei ben noti geni nel pathway d'interesse) e verificare la loro annotazione gene nella tua prfamiglie edicted ai collegamenti di questa rete per la ricerca di geni i migliori candidati (Figura 3). Soglia di valore del coefficiente dovrebbe essere coordinata in funzione della struttura della rete e la densità di geni correlati.
- Fanno la lista di geni che si è in grado di restringere come specializzato per il percorso di destinazione.
- Controllare l'espressione genica delle specificità d'organo e le risposte allo stress dei vostri geni candidati.
8. L'integrazione di tutte le informazioni per predire Nuovi percorsi
- Aggiungere geni ben caratterizzati che sono state usate per l'interrogazione di co-espressione di analisi previsto via metabolica.
- Controllare le parti non caratterizzate in questo percorso, ad esempio, non caratterizzato reazioni enzimatiche, le proteine di trasporto e fattori di trascrizione.
- Prevedere annotazione gene più adatto per questi passaggi mancanti non caratterizzate.
- Combinare i risultati di profiling e di metabolita di geni candidati in silico geNE espressione basato sul percorso previsto.
- Disporre i geni candidati sul sentiero previsto in base alla funzione del gene, per esempio, acetiltransferasi per metabolita acetilato, glicosiltransferasi per glicoside, P450 per i composti ossidati. Albero analisi filogenetica di sequenze amminoacidiche è utile per una famiglia genica ampio come P450 e glicosiltrasferasi.
- Verificare la coerenza delle specificità dei tessuti o delle risposte di stress tra l'accumulo di metaboliti e livello di espressione genica di geni candidati.
- Controllare i collegamenti al metabolismo altro per fornire i geni del substrato e lo stress reattivi.
9. Esperimenti per l'identificazione del gene mediante Bio-risorse
- Verificare la disponibilità di risorse biologiche per la facilitazione della sperimentazione per l'identificazione del gene candidato.
- Eseguire un esperimento per l'identificazione della funzione del gene utilizzando risorse biologiche, quali biblioteca KO mutante e full-length cDNA library. Tsperimenta funzionale per l'identificazione di geni con la preparazione di piante sovraespressione e mutanti knockout, analisi enzimatica e analisi promotore vincolanti, devono essere eseguiti per i geni migliori candidati nel vostro pronostico. Proteina ricombinante saggio per la caratterizzazione delle proprietà della proteina e la preparazione di piante sovraespressione meglio essere effettuata dopo la conferma del profilo dei metaboliti utilizzando KO mutante poiché richiede molto più per preparare proteina ricombinante e la clonazione del gene per la trasformazione.
10. Risultati rappresentativi
La procedura di analisi integrato descritto in questo protocollo ha molte possibilità a seconda della specifica finalità sperimentali e la scelta di combinazioni biologiche ed analitiche. Scelta delle procedure e il disegno sperimentale deve essere effettuata correttamente, sulla base del percorso di destinazione, i composti e specie vegetali. La strategia di integrazione descritto in questo protocollo è foc utilizzato su annotazione della funzione dell'impianto gene e la scoperta di nuove funzioni dei geni, con un uso efficiente di diversi bio-dati e delle risorse. Risultato atteso è promesso di fornire l'unico caso della previsione definitiva. Questo fatto indica che, se prove sufficienti non può essere dato da profili di combinazione, l'esperimento non deve essere iniziato. Per questo motivo, in ogni caso, ulteriori esperimenti preliminari quali profili di espressione genica mirata di RT-PCR, possono supportare la previsione della funzione del gene. La precisione e la correttezza della predizione correla superiore in funzione della differenza qualitativa e il numero di variazione della combinazione. Inoltre, i candidati risultati buoni e validi può venire solo dalla previsione accurata dei percorsi. Annotazione di picco dovrebbe essere condotta con la combinazione di diversi approcci, per il rilevamento ad esempio la letteratura, estratto della pianta di riferimento, MS n, la specificità d'organo e l'analisi mutante 13.
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Figura 1. Panoramica del flusso sperimentale di annotazione genica tramite approccio combinato. In alcuni casi, i progetti iniziano con la scoperta di un picco romanzo che viene rilevato in condizioni particolari o tessuti, e il desiderio di capire il suo ruolo all'interno del suo metabolismo. In altri casi lo scopo del progetto è l'identificazione del gene o la scoperta dei principali fattori di regolazione, quali fattori di trascrizione. Progettazione di esperimento dovrebbe essere piallato con una serie di dati che mostra chiare differenze dei livelli di metabolita nel vostro percorso di destinazione, utilizzando una vasta gamma di campioni di tessuto da organi diversi, e per le piante coltivate in modo differenziale o piante esposte a condizioni di stress, e sottoponendo il materiale a profiling metabolita. Le piante mutanti e transgeniche, nonché QTL materiale di riproduzione ospitare anche rappresentare adatto materiale genetico per questi studi. Previsione del percorso romanzo deve essere effettuata accuratamente con accurateannotazione di picco e l'approccio combinazione con diversi tipi di metabolotype come i titoli di organi e risposte allo stress secondo i dati di espressione genica del vostro percorso d'interesse. Nell'ultimo passaggio, profiling metabolita e trascrizione deve essere effettuata che alla fine, quando combinato con analisi in silico di web-risorse e caratterizzazione in vitro di espressione genica mediante espressione eterologa, portano alla conferma del gene candidato e la spiegazione della sua funzione e posizione all'interno di una via metabolica. Abbreviazioni: QTL, i loci di caratteri quantitativi.
Figura 2. Il flusso di lavoro di approccio combinatorio per l'annotazione di picco. Una procedura per l'identificazione di picco e annotazione dal composto standard, confronto tra wild type e mutanti knock out, multi-dimensionale spettrometria di massa del picco target di riferimento agli spettri di massa di pura comlibra dai database 12. Abbreviazioni: DB, database; KO, knock-out, 1-D, uno-dimensionali; 2-D, bidimensionali, NMR, risonanza magnetica nucleare, IR, infrarossi; MS n, di massa di massa spectrometries.
Figura 3. Esempio coregolamentazione analisi rete del percorso antocianine. Coespressione analisi sono state eseguite utilizzando il PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) sulla base dei dati impostati di versione ATTEDII 3 8,2 con l' Pajek programma ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Correlazioni positive (r <0,5) sono utilizzati per stabilire connessioni di rete. Red nodo: dodici geni enzimatici (antociani At5g13930, CHS e TT4, calcone sintasi, At3g55120, CHI, TT5, calcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-idrossilasi; At5g07990, F3'H, TT7, flavonoide 3'-idrossilasi; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoide 3 - O-glucosiltransferasi; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonolo reduttasi, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Antocianidina Synthese; At4g14090, A5GT, antociani 5 - O-glucosiltransferasi; At5g54060, A3G2 "XT, putativo antociani 3 - O-glucoside 2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antociani 5 - O-glucoside 6'' '- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antociani 3 - O-glucoside 6 "- O - P-coumaroyltransferase) e due fattori di trascrizione per la produzione di antocianine (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) è stato utilizzato per la ricerca di geni candidati geni candidati sono stati trovati da un "intersezione di insiemi" ricerca con un valore di soglia con un coefficiente di r <./ Em >> 0,50 interrogato dalla intersezione di scene di tutti i geni interrogato (quattordici geni biosintetici antociani). A co-espressione della rete, compresi i geni candidati correlati (68 geni) e di geni interrogati (14 geni), è stato ricostruito da un "interconnessione di insiemi" di ricerca con r> 0.50 utilizzando il database PRIME. I file di output che sono stati formattati con un file '. Net' dal database PRIME e delle reti sono stati elaborati utilizzando il software Pajek. Nodo blu indica geni candidati, che con i geni correlati antociani.
| specie | Maggiore secondaria metabolita |
| Arabidopsis thaliana | Glucosinolati, flavonoli, antociani, derivato sinapoyl |
| Populus trichocarpa | Flavonoli, antociani, derivato salicilato |
| Vitis vinifera | Flavonoli, antociani, tannini, stilbene |
| Solanum lycopersicum | Flavonoli, antociani, glycoalkaloid, chrologenate correlato, |
| Nicotiana tabacum | Flavonoli, antociani, nicotianamide, chrologenate correlato, acylsugar |
| Oryza sativa | Glycoflavone, antociani, steroli derivati |
| Zea maggio | Glycoflavone, antociani, benzoxazinone, derivati degli steroli |
| Medicago truncatula | Isoflavoni, antociani, saponina, |
| Japonica Lotus | Isoflavone, flavonoli, antociani, saponina, |
Tabella I. principali metaboliti secondari in specie vegetali modello.
| Co-espressione di database | Indirizzo |
| Pianta a croce specIES | |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V |
| PlaNet | http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ |
| Specie vegetali | |
| ATEED-II | http://atted.jp/ |
| BAR | http://142.150.214.117/welcome.htm |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop |
| GeneCAT | http://genecat.mpg.de/ |
| Arabidopsis | |
| ACT | http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser |
| AthCoR@CSB.DB | http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html |
| CressExpress | http://cressexpress.org/~~V |
| PRIME | http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index |
| Oryza sativa | |
| RiceArrayNet | http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V |
| Rice Array Database | http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml |
Tabella II. Disponibile banca dati di espressione genica in silico per la co-analisi di espressione.
Discussion
Dato che trascrittomica metabolomica e le tecnologie sono state utilizzate per diversi anni, il processo di integrazione dei dati per la metabolomica assistiti annotazione gene inizia generalmente con l'identificazione di un picco romanzo rappresenta un metabolita sconosciuto. Questo fatto porta alla fase successiva, che è quello di valutare la varianza quantitativa picchi metabolita o dei nuovi geni candidati ritenuti responsabili per il loro biosintesi. La strategia descritta in questo protocollo, tuttavia, ha tre problemi principali i) difficoltà di annotazione picco, ii) complessità di predizione percorso, iii) la risoluzione delle informazioni gene e la qualità dei dati di espressione genica. Per contrastare il primo problema, l'annotazione di picco deve essere eseguita con il co-eluizione di composti standard o le informazioni approccio combinatorio che utilizza da MS n analisi, estratto di riferimento, l'analisi mutante, ricerca su database metabolita e rassegna della letteratura (Figura 2, 12). Per il seconda problema, la previsione di percorso può essere ottenuto soltanto con annotazione di picco corretto. Tuttavia, profilatura metabolita della specificità del tessuto può anche essere picco annotazione supporto, perché accumulo metabolita deve essere correlata con le espressioni di geni correlati. Pertanto profili combinazione di diversi tessuti e condizioni di crescita può essere utile per questo secondo problema. Il terzo problema riguardante la risoluzione di informazioni gene dipende dai progressi dei dati di sequenza. Nel caso dell'impianto modello senza completamento della sequenza del genoma, co-espressione analisi utilizzando geni ortologhi in altre piante modello è utile. Il confronto e l'allineamento dettagliata analisi dell'albero filogenetico della sequenza di amminoacidi in grado di supportare la connessione organismi modello ad altre specie.
Questo protocollo è adatto a tutti metabolismi. È più efficiente nell'analisi di metabolismi intermedi e secondarie che sono ben caratterizzati ad essere soggetti a forti c trascrizionaleONTROLLO 1,5,11,16. In alcuni esempi, co-espressione di analisi riuscita essere eseguita in assimilazione zolfo, geni per la β-ossidazione, a catena ramificata degradazione aminoacidica, ripartizione clorofilla, e il catabolismo lisina 3, il metabolismo cellulare parete 10,7 e segnalazione luminosa cascata 14. Annotazione della funzione del gene via genomica combinati, la metabolomica e l'informatica non è solo per il gene di biosintesi e regolatore diretto del fattore di trascrizione, ma anche per capire processo fisiologico e la risposta (si veda ad esempio la figura 3. 14).
Per sviluppare questo approccio da piante modello a specie vegetali, il confronto metabolica tra le specie di piante è l'approccio efficace in alcuni metabolismo generale. Per esempio, se stesso composto viene rilevato in diverse specie vegetali, e alcuni geni ortologhi sono presenti in queste specie di piante, cross specie co-espressione analisi utilizzando ortologhi geni può fornire strong supporto per il vostro pronostico. Questo approccio può essere eseguita in Arabidopsis, pioppo, Medicago, oltre importanti colture quali orzo, riso, frumento e soia, da co-espressione analisi di specie vegetali (6, PlaNet: http://aranet.mpimp-golm.mpg . de / ,, 9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ ; vedere un esempio, 15).
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Prof. Kazuki Saito in RIKEN PSC e il dottor Bjoern Usadel in MPIMP utili per le discussioni. TT è supportato da una borsa di studio della Alexander von Humboldt Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water ULC/MS grad | BIOSOLVE | 23214102 | |
| Acetonitrile (ACN) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 01204102 | |
| Methanol (MeOH) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 13684102 | |
| Formic acid (HCOOH) ULC/MS grade for liquid chromatography | BIOSOLVE | 06914131 | |
| Standard compounds | EXTRASYNTHESE | ||
| Linear ion trap (IT) ESI-MS system FINNIGAN-LTQ | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| HPLC system Surveyor | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Analytical column Luna C18(2), 2.0 mm diameter, 150 mm length, 100 Å pore size and spherical particles of 3 mm | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
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