Summary
Kombination av genomik, samexpression gen analys och identifiering av målföreningar via metabolism ger genen funktionell anteckning.
Abstract
Med tanke på det ständigt växande antalet arter modell anläggningar för vilka fullständiga genomet sekvenser finns och det överflöd av biologiska resurser såsom knockout-mutanter, vilda anslutningar och avancerade populationer avel, finns det ett ökande belastning för gen funktionell annotation. I detta protokoll, annotering av växt-genfunktion med kombinerad samuttryck gen analys, metabolomik och informatik tillhandahålls (figur 1). Denna strategi grundar sig på teorin att använda målgener av känd funktion för att möjliggöra identifiering av icke-annoterade gener risk att bli inblandad i en viss metabolisk process, med identifieringen av målföreningar via metabolomik. Strategier läggs fram för att tillämpa denna information på populationer som genereras av både framåt och bakåt genetik metoder trots ingen av dessa är lätt. Genom följd detta tillvägagångssätt kan även användas som en metod för att karakterisera okända toppar som representerar nya eller särskilda seefter att ge metaboliter i de begränsade vävnader, växtarter eller spänning behandling, som för närvarande är den viktiga rättegången att förstå anläggning metabolism.
Protocol
1. Provberedning
- Växtmaterial skördas och fryses omedelbart.
- Frysta vegetabiliska material pulvriseras genom biandaren kvarn (eller mortel) och lagras i Falcon-rör eller Eppendorf-rör vid -80 ° C.
2. Extraktion för metabolitprofilering
- Alikvot frystes växtmaterial i en 2 ml Eppendorf-rör.
- Tillsätt 5 il extraktionsbuffert per milligram färsk vikt av frysta växtmaterial.
- Lägg till en metall (eller gilconia) boll och homogenisera av fryst pulver med mixern Mill i 2 min vid 25 ls -1.
- Centrifiigera 10 min vid 12.000 varv per minut.
- Överför supernatanten till Nanosep centrifugalfilter.
- Centrifugera 2 minuter vid 4.000 rpm.
- Överför supernatanten till nya Eppendorf-rör och lagra vid -20 ° C fram till användning.
3. Metabolitprofilering genom LC-MS
- Ställ in HPLC och kontrollera temperaturen i kolumn ugn och provbricka.
- Ställ in MS skick och kontrollera tillståndet av vakuum och värme kapillär.
- Utför m / z kalibrering av MS detektor.
- Överföring av 50 | il av extrakt till glasampull för LC-MS.
- Spruta in 5 il extrakt till LC-MS.
4. Dataanalys
- Konfigurera Xcalibur eller Metalign 4 och välj dataanalys som skall behandlas.
- Förbered en tabell över detekterade topparna i ditt intresse i enlighet med förening klass i tabell jag.
- Identifiera toppar genom sam-eluering av standardföreningar.
- Kommentera upptäcks toppar med MS 2-analys, litteratur undersökning metabolit databassökning (figur 2, 12,13).
5. Förutsägelse av metaboliska vägen
- Konstruera en möjlig väg med detekterade föreningar. Prediktion av vägen med topp kommentarer bör baseras på den kemiska strukturen hos upptäckt förenings genom att förutsäga länka enzymatiska funktioner på den metaboliska vägen 13. Strukturera biosyntetiska steg bör utföras med exakt toppen annotation. Men bestämningen av detaljerad kemisk struktur, t ex socker-enhet, är inte nödvändigt i detta steg, eftersom förutsägelse av sockerenheten och aducerade läge är mycket svårt att identifiera med MS-analys. Fastställande av socker typ såsom hexoside och pentoside kommer att identifieras genom enzymatisk analys av socker donator i sista steget i projektet. Mestadels bygga om förutsägelse av vägen bör utföras så liten molekyl är mellanprodukt med större molekylen utom i de vissa fall, såsom uttorkning reaktion. Listan av atomärt molekylvikt, t ex 16 m / z för skillnaden mellan-H och-OH-gruppen (oxidation), 14 m / z (kolatomen) för skillnaden mellan-OH och-OMe (metylering) och 162 m / z ( MW-H2O) för hexos (glykosylering), är användbar för att förutsäga. Bestämning avmodifiering typ med korrelationsanalys av vävnader särdrag bidrar förutsägelse av metaboliska väg. Databas över allmänna metabolismväg som Kegg databas ( http://www.genome.jp/kegg/ ) och PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ) är mycket effektiv för att förutsäga metabolismen för ditt intresse.
6. Beredning av Gene Lista med Arabidopsis ortologa Gene ID
- Nedladdningslista gen ID från genomisk databas.
- Lägg Arabidopsis gen ID ortologa gen, vid ditt mål anläggningen inte Arabidopsis.
- Förbered en lista av gener i din väg av intresse. Notering av Arabidopsis pathway data och gen uppgifter familj finns i TAir webbplats ( http://www.arabidopsis.org/~~V ). Om du upprättat en lista över Arabidopsis ortologa gener, kan du kombi sedanne dem.
7. Samuttryckt Gene Analysis
- Testa att använda upprättade förteckningen genen ID för att söka bästa databasen för din väg genom att kontrollera korrelationen med välkända genpar i din väg av intresse (Tabell II). Om samexpression databas eller genuttryck databasen finns inte i anläggningen för ditt intresse, bör Arabidopsis samuttryck databas användas med en lista över Arabidopsis ortologa gener. I fall av korn, kan ris, poppel, vete, Medicago och sojaböna, samuttryck analys av växtarter användas (tabell II).
- Konstruera ramen för din målgrupp samuttryck nätverk baserat på anslutningarna av de väl kända gener i din väg av intresse.
- Lägg korrelerade kandidatgener (R <0,4 ~ 0,90, inom ungefärliga värdet koefficient värde mellan anslutningarna av de väl kända gener i din väg av intresse) och kontrollera deras gen anteckning i predicted familjer till anslutningar detta nätverk för att hitta bästa kandidatgener (Figur 3). Tröskelvärde på koefficient värde bör samordnas enligt nätverksstruktur och densitet korrelerade gener.
- Gör lista över gener som du har möjlighet att begränsa som specialiserat till ditt mål väg.
- Kontrollera genuttryck av organ särdrag och svar stress i ditt kandidatgener.
8. Integration av all information att förutse nya vägar
- Lägg väl karakteriserade gener som har använts för sökning av samuttryck analys förutspådde metaboliseringsvägen.
- Kontrollera okarakteriserade delar i denna väg, till exempel okaraktäriserat enzymatiska steg, proteiner transporter och transkriptionsfaktorer.
- Förutse mest lämpliga gen anteckning för dessa okarakteriserade saknade steg.
- Kombinera resultaten av metaboliten profilering och kandidatgener för i silico GEne uttryck baserat på den förutsagda banan.
- Ordna kandidatgener för den beräknade vägen beroende på genfunktion, till exempel acetyltransferas för acetylerade metabolit, glykosyltransferaset för glykosid, P450 för oxiderade förening. Fylogenetiskt träd analys av aminosyrasekvenser är användbar för vissa breda genfamiljen såsom P450 och glykosyltransferas.
- Kontrollera konsistens vävnad särdrag eller svar spänning mellan metabolit ackumuleras och genuttryck nivå kandidatgener.
- Kontrollera anslutningarna till andra metabolism för att ge substrat och stress känsliga gener.
9. Experiment för Gene identifiering med Bio-resurser
- Kontrollera tillgången bioresurser för underlättande av experiment för kandidaten gen identifiering.
- Gör ett experiment för att identifiera geners funktion med hjälp bioresurser, såsom KO mutant bibliotek och full cDNA bibliotek. Than experiment för funktionell identifiering av gener med beredning av överuttryck växter och mutanter knockout, enzymatiska assay och promotor bindningsanalysen måste utföras för bästa kandidatgener i din förutsägelse. Rekombinant protein analys för karakterisering av protein egenskaper och beredning av överuttryck växter bättre skall utföras efter bekräftelse av metabolit profil med KO mutant eftersom det tar betydligt längre tid att förbereda rekombinant protein och gen kloning för transformation.
10. Representativa resultat
Förfarandet för integrerad analys som beskrivs i detta protokoll har många möjligheter, beroende på viss experimentell syfte och val av biologiska och analytiska kombinationer. Valet av förfaranden och experimentell design bör göras på rätt sätt på grund av ditt mål väg, föreningar och växtarter. Den integrationsstrategi som beskrivs i detta protokoll är FOC används på notering av växt-genfunktion och upptäckten av nya genfunktioner med en effektiv användning av flera bio-och data-resurs. Förväntade resultatet är lovade att förse med det enda fallet av avgörande förutsägelse. Detta faktum tyder på att om tillräckligt många bevis inte kan ges av en kombination profiler bör försök inte startas. Av denna anledning i några fall kan ytterligare preliminära experiment som riktade profilering av genuttryck av RT-PCR, stödjer din förutsägelse av genfunktion. Noggrannhet och korrekthet förutsägelse korrelerar högre beroende på kvalitativa skillnaden och antal variation av kombination. Dessutom kan goda kandidater och giltiga resultat kommer endast korrekt förutsägelse av vägar. Peak anteckning bör ledas av en kombination av flera metoder, till exempel litteraturstudie, referens växtextrakt, MS N analys, orgel specificitet och mutant analys 13.
1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/>
Figur 1. Översikt över den experimentella flödet av genen annotation via kombinerade tillvägagångssättet. I vissa fall projekt börjar med upptäckten av en ny topp som upptäcks i särskilda villkor eller vävnader, och önskan att förstå sin roll i sin metabolism. I andra fall syftet med projektet är genidentifiering eller upptäckt av centrala faktorer som transkriptionsfaktorer. Design av försöket bör hyvlas med en datamängd som visar tydliga skillnader av metabolit nivåer i din målgrupp väg, med hjälp av ett brett spektrum av vävnadsprover från olika organ, och för differentiell odlade växter eller växter utsätts för påfrestningar, och utsätta materialet till metabolit profilering. Mutant och transgena växter samt QTL hysande avelsmaterial representerar också lämpligt genetiskt material för dessa studier. Förutsägelse av ny väg måste utföras noggrant med korrekttopp notering och kombination strategi med olika typer av metabolotype som organ värdepapper och svar belastning enligt genuttryck uppgifter på din väg av intresse. I det sista steget, bör metabolit och utskrift profilering utföras som så småningom kommer i kombination med in silico analys av webb-resurser och in vitro karaktärisering av genuttryck via heterologt uttryck, att leda till en bekräftelse av genen kandidaten och klarläggande av dess funktion och position i en metabolisk väg. Förkortningar: QTL och quantitative trait loci.
Figur 2. Arbetet flöde av kombinatoriska metod för topp notering. En förfarande för peak identifikation och anteckningar av standarden föreningen, jämförelse av vild typ och slå ut mutanter, multi-dimensionell masspektrometri av målet toppen hänvisning till masspektra av ren compounds från databaserna 12. Förkortningar: DB, en databas, KO, knock-out, 1-D, en-dimensionella, 2-D, tvådimensionella, NMR, kärnmagnetisk resonans, IR, infraröd, MS n, massa-massa spectrometries.
Figur 3. Exempel samreglering nätverk analys av antocyanin vägen. Samexpression utfördes med hjälp av PRIME ( http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index ) baserat på de uppgifter som i ATTEDII version 3 8,2 med Pajek programmet ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Positiva korrelationer (R <0,5) används för att göra nätverksanslutningar. Röd nod: tolv antocyaninfärgning enzymatiska gener (At5g13930, CHS och tt4 och chalkonsyntas; At3g55120, CHI, TT5, chalkon isomerisera, At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hydroxylas, At5g07990, F3'H, TT7, flavonoid 3'-hydroxylas, At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid 3 - O-glukosyltransferas, At5g17220, AtGSTF12, TT19 , At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol reduktas, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, antocyanidin Synthese, At4g14090, A5GT, antocyanin 5 - O-glukosyltransferas, At5g54060, A3G2 "XT, förmodade antocyanin 3 - O-glukosid 2" - O - xylosyltransferas, At3g29590, A5GMaT, antocyanin 5 - O-glukosid 6'' '- O-malonyltransferas, At1g03940, A3GCouT, antocyanin 3 - O-glukosid 6 "- O - p-coumaroyltransferase) och två transkriptionsfaktorer för antocyaninfärgning produktion (At1g56650, PAP1, At1g66390, PAP2) användes för att söka kandidatgener kandidatgener hittades av en "korsning uppsättningar" Sök med ett tröskelvärde med en koefficient av r <./ Em >> 0,50 ifrågasattes av korsningen av uppsättningar av alla tillfrågade gener (fjorton antocyaninfärgning biosyntetiska gener). En samexpression nätverket, inklusive korrelerade kandidatgener (68 gener) och efterfrågade gener (14 gener), re-konstruerad av ett "sammankoppling av apparater" Sök med r> 0,50 med PRIME databasen. De utgående filer som är formaterade med ett ". NET" filen från PRIME databasen och nätverk drogs med Pajek programvara. Blå nod indikerar kandidatgener som korrelerade med antocyaninfärgning gener.
| arter | Större sekundär metabolit |
| Arabidopsis thaliana | Glukosinolathalt, flavonol, antocyanin, sinapoyl derivat |
| Populus trichocarpa | Flavonol, antocyanin, salicylat derivat |
| Vitis vinifera | Flavonol, antocyanin, tannin, stilben |
| Solanum lycopersicum | Flavonol, antocyanin, glycoalkaloid, chrologenate närstående, |
| Nicotiana tabacum | Flavonol, antocyanin, nicotianamide, chrologenate relaterade, acylsugar |
| Oryza sativa | Glycoflavone, antocyanin, sterolderivat |
| Zea kan | Glycoflavone, antocyanin, bensoxazinon, sterolderivat |
| Medicago truncatula | Isoflavon, antocyanin, saponin, |
| Lotus japonica | Isoflavon, flavonol, antocyanin, saponin, |
Tabell I. Stora sekundära metaboliter i arter modell växter.
| Samuttryck databasen | Adress |
| Växt över specer | |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V |
| PlaNet | http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ |
| Växtarter | |
| ATEED-II | http://atted.jp/ |
| BAR | http://142.150.214.117/welcome.htm |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop |
| GeneCAT | http://genecat.mpg.de/ |
| Arabidopsis | |
| AGERA | http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser |
| AthCoR@CSB.DB | http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html |
| CressExpress | http://cressexpress.org/~~V |
| PRIME | http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index |
| Oryza sativa | |
| RiceArrayNet | http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V |
| Ris Array Databas | http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml |
Tabell II. Finns genuttryck databas för in silico samuttryck analys.
Discussion
Med tanke på att transkriptomik och metabolomik tekniker har använts i flera år, börjar processen av data integration för metabolomik hjälpt gen anteckning allmänhet med identifieringen av en ny topp som representerar en okänd metabolit. Detta faktum leder till nästa steg som är att utvärdera kvantitativa variationer i metabolit toppar eller de nya kandidatgener tros vara ansvarig för biosyntes. Strategin som beskrivs i detta protokoll har dock tre stora problem i) svårigheter av topp notering, ii) komplexitet väg förutsäga, iii) upplösning av geners information och kvaliteten på uppgifter genuttryck. För att motverka det första problemet, bör peak notering ske med sameluering av standard föreningar eller kombinatoriska metoden att använda information från MS n-analys, referens extrakt, mutant analys metabolit databassökning och litteratur undersökning (figur 2, 12). För SNDRA problem, kan bana förutsägelse endast erhållas genom korrekt topp anteckning. Men metabolit profilering av vävnad specificitet kan också vara stöd topp anteckning, eftersom metabolit ackumuleras bör korreleras med genuttryck av relaterade gener. Därför kombination profiler av olika vävnader och villkor tillväxt kan vara till hjälp för denna andra problem. Det tredje problemet med upplösningen av gen information beror på hur sekvensdata. Vid modellen växt utan avslutad genomsekvens, är sam-expression analys med användning av ortologa gener i andra modeller växter nyttig. Detaljerad anpassning jämförelse och fylogenetiskt träd analys av aminosyrasekvens kan stödja att ansluta modellorganismer till andra arter.
Detta protokoll är lämplig för alla ämnesomsättning. Det är mest effektiv vid analys av mellanliggande och sekundära metabolism som är väl kännetecknas bli föremål för en stark transkriptionell CKONTROLL 1,5,11,16. I några exempel samuttryck analys lyckats att utföras av svavel assimilering, gener för β-oxidation, grenade aminosyror nedbrytning, klorofyll nedbrytning och lysin katabolismen 3, cellväggen metabolism 10,7 och ljussignalanordningarnas kaskad 14. Notering av geners funktion via kombinerade genomik, metabolomik och informatik är inte bara för biosyntetiska gen och direkt regulator av transkriptionsfaktor, men också för att förstå fysiologisk process och svar (se t.ex. figur 3. 14).
För att utveckla denna metod från modell växter till grödor är metabolisk jämförelse av olika växtarter kraftfull metod i vissa allmänna ämnesomsättning. Till exempel, om samma förening detekteras i olika växtarter, och vissa ortologa gener hittas i dessa växter, kan tvär arter samuttryck analys med användning av ortologa gener ge strong support för din förutsägelse. Detta tillvägagångssätt kan utföras i Arabidopsis, poppel, Medicago, utöver viktiga grödor såsom korn, ris, vete och sojabönor, genom samuttryck analys av växtarter 6 (, planet: http://aranet.mpimp-golm.mpg . de / ,; 9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ , se exempel 15).
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Kazuki Saito i RIKEN PSC och Dr Björn Usadel i MPIMP för användbara diskussioner. TT stöds av ett stipendium från Alexander von Humboldt-stiftelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water ULC/MS grad | BIOSOLVE | 23214102 | |
| Acetonitrile (ACN) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 01204102 | |
| Methanol (MeOH) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 13684102 | |
| Formic acid (HCOOH) ULC/MS grade for liquid chromatography | BIOSOLVE | 06914131 | |
| Standard compounds | EXTRASYNTHESE | ||
| Linear ion trap (IT) ESI-MS system FINNIGAN-LTQ | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| HPLC system Surveyor | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Analytical column Luna C18(2), 2.0 mm diameter, 150 mm length, 100 Å pore size and spherical particles of 3 mm | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
- Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays. Plant Cell. 12, 647-661 (2000).
- Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics. In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).
- Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria. Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).
- De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nat. Protoc. 2, (2007).
- Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).
- Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species. Plant Cell. 23, 895-910 (2011).
- Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis. Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).
- Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis. Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).
- Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants. Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).
- Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).
- Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes. Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).
- Tohge, T., Fernie, A. R. Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide. Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).
- Tohge, T., Fernie, A. R. Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function. Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).
- Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation. Plant Signal Behav. 6, Forthcoming (2011).
- Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole. Plant Physiol. , (2011).
- Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).
