Summary
신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.
Abstract
전체 게놈 시퀀스를 사용할 수있는 등 한방의 돌연변이, 야생 accessions 및 고급 번식 집단 등의 바이오 자원을 풍부하게하는 모델 식물 종의까지 확대 수를 감안할 때, 유전자의 기능적인 해설을 위해 상승 부담이 있습니다. 이 프로토콜에서는 결합된 공동 발현 유전자 분석을 이용한 식물 유전자 기능의 주석은, metabolomics 및 정보학은 (그림 1) 제공됩니다. 이 접근법은 metabolomics 통해 목표 화합물의 신분으로 특정 대사 과정에 참여하지 않은 주석이 유전자의 식별 가능성이 허용하는 것으로 알려진 함수의 대상 유전자를 사용하여 이론에 근거한다. 전략은 손쉽게있는 이들 없음에도 불구하고 모두 순방향 및 역방향 유전자 접근 방법에 의해 생성된 인구에서이 정보를 적용하기위한 개진하고 있습니다. 추론으로이 접근법은 또한 신규 또는 특정 SE를 나타내는 미지의 봉우리를 특성화하는 방식으로 사용할 수 있습니다제한된 조직, 식물의 종 또는 현재 식물의 신진 대사를 이해하는 중요한 시험이다 스트레스 치료에서 condary metabolites.
Protocol
1. 샘플 준비
- 식물 재료는 수확 즉시 냉동있다.
- 냉동 식물 재료는 -80 ° C.에 믹서 분쇄기에 의해 가루 (또는 절구)와 팔콘 튜브 또는 Eppendorf 튜브에 저장됩니다
2. 신진 대사 프로파일을위한 추출
- 나누어지는는 2 ML Eppendorf 튜브에 식물 재료 냉동.
- 냉동 식물 소재의 신선한 무게 밀리그램 당 추출 버퍼의 5 μl를 추가합니다.
- 25인가 -1에서 2 분 믹서 밀 하나의 금속 (또는 gilconia) 볼을 넣고 냉동 분말의 homogenize.
- 12,000 rpm으로 10 분 원심 분리기.
- 원심 필터를 NANOSEP하기 뜨는을 전송합니다.
- 4,000 rpm으로 2 분을 원심 분리기.
- 사용할 때까지 -20 ° C에서 새로운 Eppendorf 튜브, 그리고 저장소로 뜨는을 전송합니다.
3. LC-MS에 의한 신진 대사 프로 파일링
- HPLC를 설정하고 열 오븐 및 샘플 트레이의 온도를 확인.
- MS 조건을 설정하고 진공과 가열 모세관의 상태를 확인합니다.
- MS 검출기의 M / Z 보정을 수행합니다.
- LC-MS에 대한 추출물의 50 μl의 유리관에 전송합니다.
- LC-MS에 추출물의 5 μl를 주입.
4. 데이터 분석
- Xcalibur 또는 Metalign 4를 구성하고 처리하는 데이터 분석을 선택합니다.
- 표 봐도에서 화합물 클래스에 따라 귀하의 관심 감지 봉우리의 테이블을 준비합니다.
- 표준 화합물의 공동 용출하여 봉우리를 식별합니다.
- 주석은 MS이 분석, 문헌 조사, 신진 대사 데이터베이스를 검색합니다 (그림 2, 12,13)를 사용하여 봉우리를 발견했습니다.
5. 대사 경로의 예측
- 검색된 화합물로 가능한 통로를 구축. 피크 주석을 사용하여 경로의 예측은 검색된 화합물의 화학적 구조에 기초해야대사 경로 13 효소 기능을 연결하는 예측하여의. 구조화 biosynthetic 단계는 정확한 피크 주석과 함께 실시되어야한다. 설탕 잔기와 adducted 위치 예측은 MS 분석에 의해 파악하는 것은 매우 어렵기 때문이죠 그러나 세부적인 화학 구조의 결정은, 예를 들어 설탕 잔기에 대해이 단계에서 필수가 아닙니다. 이러한 hexoside 및 pentoside 같은 설탕 유형의 결정은 프로젝트의 마지막 단계에서 설탕 기증자의 효소 분석에 의해 식별됩니다. 대부분 경로의 예측 건설은 작은 분자 같은 탈수 반응과 같은 일부 경우를 제외하고 큰 분자의 중간 그대로 수행해야합니다. 예를 들어 원자 분자량 목록, 16-H 사이의 차이에 대한 M / Z 및-OH 잔기 (산화), 14 M / Z (탄소 원자) 차이에 대한간에-OH 및-OMe (methylation)와 162m / Z ( hexose (글리코 실화)에 대한 MW-H 2 O)를 예측하는 데 유용합니다. 의 결정조직의 specificities의 상관 분석과 수정 유형은 대사 경로의 예측을하는 데 도움이됩니다. 이러한 KEGG 데이터베이스 (같은 일반적인 대사 경로의 데이터베이스 http://www.genome.jp/kegg/ )와 PlantCyc은 ( http://plantcyc.org/~~V )에 관심의 대사 경로의 예측에 매우 효과적입니다.
6. Arabidopsis Orthologous 유전자 ID를 가진 유전자 목록의 작성
- 게놈 데이터베이스로부터 유전자의 ID 목록을 다운로드합니다.
- , orthologous 유전자의 Arabidopsis 유전자 ID를 추가하여 타겟 공장의 경우 Arabidopsis 않습니다.
- 귀하의 통로 -의 - 관심 유전자의 목록을 준비합니다. Arabidopsis 경로 데이터와 유전자 가족 데이터의 해설 테어 웹사이트 (에서 사용할 수 있습니다 http://www.arabidopsis.org/~~V ). 당신은 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 준비하면 이후 combi 수NE 그들.
7. 공동 표명 유전자 분석
- 귀하의 통로 -의 - 관심 (표 II)에서 잘 알려진 유전자 쌍을 사용하여 상관 관계를 선택하여 경로에 대한 최고의 데이터베이스를 검색할 수있는 준비된 유전자의 ID 목록을 사용하여 테스트합니다. 공동 표현식 데이터베이스 또는 유전자 발현 데이터베이스가 여러분의 흥미에 공장에서 사용할 수없는 경우, Arabidopsis 공동 식은 데이터베이스는 Arabidopsis orthologous 유전자의 목록을 사용해야합니다. 보리의 경우, 쌀, 포플러, 밀, medicago와 대두, 식물 종의 공동 발현 분석 (표 II) 사용할 수 있습니다.
- 귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결을 기반으로 타겟 공동 표현식 네트워크 프레임 워크를 구축.
- 서로 관련 후보 유전자 (귀하의 통로 -의 - 관심 잘 알려진 유전자의 연결 사이의 계수 가치의 대략적인 값 내에서 R <0.4 ~ 0.90) 추가 및 홍보에 자신의 유전자 주석을 확인최상의 후보 유전자 (그림 3)을 찾는이 네트워크 연결에 edicted 가족. 계수 값의 임계값을 서로 관련 유전자의 네트워크 구조와 밀도에 따라 조정되어야한다.
- 당신의 대상 경로에 대한 전문적인하다고 좁힐 수있는 유전자의 목록을 확인하십시오.
- 당신의 후보 유전자의 장기 specificities 및 스트레스 반응의 유전자 발현을 확인합니다.
8. 새로운 경로를 예측하는 모든 정보의 통합
- 예측 대사 경로에 공동 표현 분석의 쿼리에 사용되었습니다 잘 특징 유전자를 추가합니다.
- 이 경로에 uncharacterized 부분을 확인, 예를 들어 효소 단계, 수송 단백질과 전사 요인을 uncharacterized.
- 이러한 누락 uncharacterized 단계를 위해 가장 적합한 유전자 주석을 예측.
- silico GE에의 신진 대사 프로 파일링 및 후보 유전자의 결과를 결합NE 표현은 예측 경로를 기반으로.
- oxidised 화합물에 대한 P450, 사이드위한 acetylated 신진 대사, glycosyltransferase위한 acetyltransferase 예를 들어 유전자 기능에 따라 예측된 경로, 귀하의 후보 유전자를 마련. 아미노산 시퀀스의 Phylogenetic 트리 분석은 P450과 glycosyltransferase과 같은 몇 가지 다양한 유전자 가족을 위해 유용합니다.
- 신진 대사 축적 및 후보 유전자의 유전자 발현 수준 간의 조직 specificities이나 스트레스 응답의 일관성을 확인합니다.
- 기판 및 스트레스 반응 유전자를 제공하는 다른 신진 대사에 대한 연결을 확인합니다.
9. 바이오 자원을 이용한 유전자 식별을위한 실험
- 후보 유전자 식별을위한 실험의 촉진을위한 bioresources의 가용성을 확인합니다.
- 같은 KO 돌연변이 라이브러리 및 전체 길이 cDNA 라이브러리 등 바이오 자원을 이용한 유전자 기능의 식별을위한 실험을 수행합니다. 티overexpression의 식물과 한방의 돌연변이, 효소 분석 및 발기인 구속력 분석의 준비와 유전자의 기능 확인을위한 그 실험은, 당신의 예측에서 가장 좋은 후보 유전자에 대해 수행되어야한다. 단백질 속성의 특성화 및 그 변혁을위한 재조합 단백질 및 유전자의 복제를 준비하는 데 상당히 오래 걸리기 때문에 KO 돌연변를 사용하여 신진 대사 프로필을 확인 후 진행해야하는 가장 좋은 overexpression 공장의 준비를위한 재조합 단백질 분석.
10. 대표 결과
이 프로토콜에서 설명하는 통합 분석의 절차는 지정된 실험 목적 및 생물 학적 및 분석 조합의 선택에 따라 많은 가능성을 가지고 있습니다. 절차 및 실험 설계의 선택은 대상 경로, 화합물과 식물 종의 기초로 제대로 진행해야한다. 이 프로토콜에 설명된 통합 전략은 foc입니다 여러 바이오 및 데이터 자원의 효율적인 사용과 식물 유전자 기능과 새로운 유전자 기능의 발견 주석에 사용됩니다. 예상 결과는 결정적인 예측의 유일한 케이스를 제공하겠다고 약속한다. 이 사실은 충분한 증거가 조합 프로파일에 의해 주어질 수 없다면 실험이 시작하지 말아야함을 나타냅니다. 이러한 이유로, 어떠한 경우에 RT-PCR에 의한 이러한 타겟 유전자 발현 프로 파일링 같은 추가 예비 실험, 유전자 기능의 예측을 지원할 수 있습니다. 예측의 정확도와 정확성이 높은 조합의 유사 콘텐츠의 질적 차이와 수에 따라 연결합니다. 또한, 좋은 후보자 및 유효한 결과는 경로의 정확한 예측에서 온 수 있습니다. 피크 주석은 예제 문헌 조사, 참고 식물 추출물, MS N 분석, 장기 특이성 및 돌연변이 분석 13 여러 방법의 조합에 의해 실시되어야한다.
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1 그림. 통합 접근 방식을 통해 유전자 주석의 실험 흐름의 개요. 어떤 경우에는 프로젝트는 특별한 조건이나 조직에서 발견되는 소설 피크하며, 신진 대사 내에서 그 역할을 이해하고자하는 욕구의 발견과 함께 시작합니다. 다른 경우에는 프로젝트의 목적은 이러한 전사 인자와 같은 주요 규제 요인 유전자 식별하거나 발견이다. 실험 설계는 여러 기관에서 조직 샘플의 광범위한 사용하여 대상 경로의 신진 대사 단계의 명확한 차이를 보여주는 데이터 세트와 함께 계획이었습니다, 그리고 스트레스 조건에 노출 differentially 재배 식물이나 식물과에 자료를 쓰는해야 신진 대사 프로 파일링. 돌연변이와 유전자 변형 식물뿐만 아니라 QTL 은닉 번식 재료는 또한 이러한 연구에 적합한 유전 물질을 나타냅니다. 소설 경로의 예측은 정확로 신중하게 수행되어야이러한 여러분의 통로 -의 - 관심 유전자 발현 자료에 따르면 장기 증권 및 스트레스 반응 등 metabolotype의 다른 유형 피크 주석과 조합 방식. 마지막 단계에서, 신진 대사 및 성적표 프로파일은 결국, 웹 자원의 silico 분석과 heterologous 표현을 통한 유전자 발현의 체외 특성화에 결합하면, 그 함수의 유전자 후보와 해설의 확인을 가져다 줄 수있는 수행하여야한다 그리고 대사 경로 내의 위치. 약어 : QTL, 양적 특성의 Loci.
그림 2. 피크 해설을 위해 조합 접근법의 흐름을 작동합니다. 피크 식별 및 주석 표준 화합물에 의한 야생 유형의 비교 및 뮤턴트를 내라을위한 절차, 대상 최고의 다차원 질량 분광법은 순수 com의 질량 스펙트럼을 나타내는데이터베이스를 12 파운드. 약어 : DB, 데이터베이스, 펀치 노크 아웃, 1-D, 한 차원, 2 차원, 2 차원, NMR, 핵 자기 공명, 적외선, 적외선, MS N, 대량 양산 spectrometries.
그림 3. anthocyanin 경로의 예 공동 규제 네트워크 분석. Coexpression 분석은 프라임 (를 사용하여 수행되었다 http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index 3 개 8,2 ATTEDII 버전의 설정 데이터를 기반으로)을 Pajek 프로그램 ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). 긍정적인 상관 관계는 (R <0.5) 네트워크 연결을하기 위해 사용됩니다. 레드 노드 : 열두 anthocyanin 효소 유전자 (At5g13930, CHS, TT4, chalcone의 synthase; At3g55120, C안녕, TT5, chalcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroxylase; At5g07990, F3'H, TT7, 플라 보노이드 3'-hydroxylase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, 플라 보노이드 3 - O-glucosyltransferase, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol 환원 효소, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin synthese; At4g14090, A5GT, anthocyanin 5 - O-glucosyltransferase, At5g54060, A3G2 "XT, putative anthocyanin 3 - O-glucoside 2"- O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyanin 5 - O-glucoside 6 '' '- O-malonyltransferase, At1g03940, A3GCouT, anthocyanin 3 - O-glucoside 6 "- O - P-coumaroyltransferase) 및 anthocyanin 생산을위한 두 전사 요인 (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2)는 후보 유전자를 찾기 위해 사용되었다 R의 계수와 임계값과 후보 유전자가 "세트의 교차로"에 의해 발견된 검색 <./ 그들이 쿼리 모든 유전자 (천 anthocyanin의 biosynthetic 유전자)에 의한 집합의 교차에 의해 쿼리 0.50을보기 >>. 서로 관련 후보 유전자 (68 유전자)와 쿼리 유전자 (14 유전자)를 포함하여 공동 표현식 네트워크, R>는 0.50이 국회베이스를 이용한 "세트의 상호"에 의해 다시 만들어진 검색했습니다. 프라임 데이터베이스 및 네트워크에서 '. NET'파일과 함께 서식이 있었다 출력 파일은 Pajek 소프트웨어를 사용하여 그립니다. 파란색 노드는 anthocyanin의 유전자와 상호 후보 유전자를 나타냅니다.
| 종 | 주요 신진 대사 보조 |
| Arabidopsis thaliana | Glucosinolate, flavonol, anthocyanin, sinapoyl 유도체 |
| Populus trichocarpa | Flavonol, anthocyanin, 살리실산 유도체 |
| Vitis vinifera | Flavonol, anthocyanin, 탄닌, stilbene |
| Solanum lycopersicum | Flavonol, anthocyanin, glycoalkaloid는 관련 chrologenate, |
| Nicotiana tabacum의 | Flavonol, anthocyanin, nicotianamide, acylsugar를 관련 chrologenate |
| Oryza sativa 로구나 | Glycoflavone, anthocyanin, 스테롤 유도체 |
| Zea 년 5 월 | Glycoflavone, anthocyanin, benzoxazinone, 스테롤 유도체 |
| Medicago truncatula | 아이 소플라본, anthocyanin, 사포닌, |
| japonica 로터스 | 이소플라본, flavonol, anthocyanin, 사포닌, |
모델 식물 수종의 표 전 주요 보조 metabolites.
| 공동 표현 데이터베이스 | 주소 |
| 공장 교차 사양이거야 | |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V |
| 행성 | http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/ |
| 식물 종 | |
| ATEED-II | http://atted.jp/ |
| 바 | http://142.150.214.117/welcome.htm |
| COP | http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop |
| GeneCAT | http://genecat.mpg.de/ |
| Arabidopsis | |
| 주문 | http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser |
| AthCoR@CSB.DB | http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html |
| CressExpress | http://cressexpress.org/~~V |
| 프라임 | http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index |
| Oryza sativa 로구나 | |
| RiceArrayNet | http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V |
| 쌀 배열 데이터베이스 | http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml |
표 II. silico 공동 발현 분석에 사용할 수있는 유전자 발현 데이터베이스.
Discussion
transcriptomics 및 metabolomics 기술이 몇 년 동안 사용되었음을 감안할 때, 유전자 주석을 도와 주었던 metabolomics를위한 데이터 통합의 과정은 일반적으로 알려지지 않은 신진 대사를 대표하는 소설 최고의 식별로 시작합니다. 이 사실은 신진 대사 봉우리의 양적 분산 또는 생합성 대한 책임 것으로 생각 소설 후보 유전자를 평가하는 것입니다 다음 단계로 이어집니다. 이 프로토콜에 설명된 전략은 그러나, 세 가지 주요 문제 I) 피크 주석의 어려움, II) 경로 예측의 복잡성, 3) 유전자 발현 데이터의 유전자 정보와 품질의 해상도를 가지고 있습니다. 첫 번째 문제를 대응하기 위해, 최대 주석은 표준 물질 또는 MS N 분석, 참조 추출물, 돌연변이 분석, 신진 대사 데이터베이스 검색 및 문헌 조사 (그림 2, 12)의 조합적인 접근 이용한 정보의 공동 용출과 함께 진행되어야한다. s에 대한econd 문제는 경로 예측은 정확 피크 주석에 의해 얻을 수 있습니다. 신진 대사 축적이 관련 유전자의 유전자 표현과 상호되어야하지만,이 조직 특이성의 신진 대사 프로 파일링 또한, 지원 피크 주석이 될 수 있습니다. 따라서 다른 조직과 성장 조건의 조합 프로파일이 두 번째 문제에 대한 도움이 될 수 있습니다. 유전자 정보의 해상도에 관한 세 번째 문제는 시퀀스 데이터의 진행에 따라 달라집니다. 게놈 시퀀스를 완료하지 않고 모델 식물의 경우에는 다른 모델 식물에서 orthologous 유전자를 사용하여 공동 표현 분석에 유용합니다. 아미노산 서열에 대한 상세한 정렬 비교 및 phylogenetic 트리 분석은 다른 수종에 모형 유기체를 연결하는 데 지원할 수 있습니다.
이 프로토콜은 모든 신진 대사에 적합합니다. 그것은 잘 강력한 transcriptional C의 대상이 될 특징 중급 및 보조 신진 대사의 분석에 가장 효율적인ontrol 1,5,11,16. 몇 가지 예제, 유황 동화에서 수행되어야 성공한 공동 발현 분석, β-산화, 측쇄 체인 아미노산 저하, 엽록소 분석하고, 라이신 catabolism 3에 대한 유전자, 세포 벽 대사 10,7 및 계단식 14 신호 빛합니다. 통합 유전체학, metabolomics 및 정보학을 통한 유전자 기능의 해설 전사 인자의 biosynthetic 유전자와 직접적인 조절을 위해뿐만 아니라 생리적 과정과 반응을 이해하는 데뿐만 아니라 (예를 들어 그림 3. 14 참조).
모델 식물에서 작물 종에 대한이 접근법을 개발하기 위해 식물 종 전체의 신진 대사 비교는 몇 가지 일반적인 신진 대사의 강력한 접근이다. 동일한 화합물이 다른 식물 종으로 감지하고, 경우 예를 들어, 일부 orthologous 유전자 이러한 식물 수종에서 발견되며, orthologous 유전자를 사용하여 크로스 종 공동 표현식 분석 stron에게 제공할 수 있습니다당신의 예측을위한 g 지원. 이 접근법은 이외에 포플러, medicago, Arabidopsis에서 수행할 수 같은 식물 종의 공동 발현 분석 (6, 플래닛에 의한 보리, 쌀, 밀과 대두 등 중요한 작물 : http://aranet.mpimp-golm.mpg . 드 / ; 9, COP : http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/가 ;) 15 예제를 참조하십시오.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 유용한 토론 MPIMP에서 RIKEN PSC 박사 Bjoern Usadel에서 교수 카즈키 사이토 감사드립니다. TT는 알렉산더 폰 훔볼트 재단의 화목에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled water ULC/MS grad | BIOSOLVE | 23214102 | |
| Acetonitrile (ACN) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 01204102 | |
| Methanol (MeOH) ULC/MS grade | BIOSOLVE | 13684102 | |
| Formic acid (HCOOH) ULC/MS grade for liquid chromatography | BIOSOLVE | 06914131 | |
| Standard compounds | EXTRASYNTHESE | ||
| Linear ion trap (IT) ESI-MS system FINNIGAN-LTQ | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| HPLC system Surveyor | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Analytical column Luna C18(2), 2.0 mm diameter, 150 mm length, 100 Å pore size and spherical particles of 3 mm | Phenomenex | 00F-4251-B0 | |
| Xcalibur software | Thermo Fisher Scientific, Inc. |
References
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