Summary
تحديد موقف دورة الخلية من مجموعة من الخلايا ، أو فهم الكيفية التي تؤثر على انتشار الاشارات ، يمكن قياس التدفق الخلوي بسهولة باستخدام هذا البروتوكول. نحن التقرير مقاربة بسيطة التجريبية لخلايا التلوين وقياس موقفهم في دورة الخلية.
Abstract
تنظيم تكاثر الخلايا والأنسجة المركزية إلى التشكل خلال تطوير الكائنات المتعددة الخلايا. وعلاوة على ذلك ، وفقدان السيطرة على انتشار الخلايا تكمن وراء أمراض من أمراض مثل السرطان. على هذا النحو هناك حاجة كبيرة لتكون قادرة على التحقيق في تكاثر الخلايا وquantitate نسبة الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. كما أنها ذات أهمية حيوية لتحديد الخلايا التي يتم indistinguishably تكرار الحمض النووي في غضون عدد أكبر من السكان. منذ قرار يرصد خلية لتتكاثر في المرحلة G1 مباشرة قبل الشروع في تركيب الحمض النووي والتقدم خلال الفترة المتبقية من دورة الخلية ، واكتشاف تركيب الدنا في هذه المرحلة يسمح لعزم لا لبس فيه للوضع القائم للتنظيم نمو الخلايا في الثقافة التجارب.
يمكن أن يكون محتوى الحمض النووي في الخلايا quantitated بسهولة التدفق الخلوي للخلايا ملطخة يوديد propidium ، صبغة الفلورسنت الإقحام الحمض النووي.وبالمثل ، يمكن quantitated نشطة من قبل خلايا الحمض النووي التوليف زراعة في حضور ثيميدين المشعة ، حصاد الخلايا ، وقياس النشاط الاشعاعي في إدراج جزء غير قابل للذوبان حمض an. لدينا خبرة كبيرة مع تحليل دورة الخلية وتوصي باتباع نهج مختلف. نحن بالتحقيق في انتشار الخلايا باستخدام bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (مختصر كمجرد BrdU) تلطيخ يكشف عن إدراج هذه النظير الثايمين في الحمض النووي توليفها في الآونة الأخيرة. التوسيم وتلطيخ الخلايا مع BrdU ، جنبا إلى جنب مع تلطيخ DNA مجموع يوديد propidium وتحليلها من جانب التدفق الخلوي 1 يوفر المقياس الأكثر دقة من الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. هو الأسلوب المفضل لدينا لأنه يجمع بين اكتشاف تركيب الدنا نشطة ، من خلال تلطيخ القائمة على الضد BrdU ، مع محتوى الحمض النووي من مجموع يوديد propidium. وهذا يسمح لفصل واضح للخلايا في مرحلة مبكرة من G1 S ، أو S في وقت متأخر من مرحلة G2 / م.وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لتحقيق العديد من الآثار منبهات مختلفة من الخلايا وكلاء الصيدلانية على التقدم من خلال تنظيم هذه المراحل دورة الخلية المختلفة.
في هذا التقرير وصفنا طرق لوضع العلامات وتلطيخ الخلايا المستزرعة ، وكذلك من خلال تحليل التدفق الخلوي. نحن تشمل أيضا أمثلة تجريبية لكيف يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الآثار المترتبة على تثبيط نمو إشارات من السيتوكينات مثل TGF - β1 ، ومثبطات التكاثري مثل مثبط كيناز cyclin التابعة ، p27KIP1. علينا أيضا أن تشمل بروتوكول بديل يسمح لتحليل الموقف في دورة الخلية من الفئات السكانية الفرعية داخل الخلايا أكبر ثقافة 5. في هذه الحالة ، ونحن لشرح كيفية الكشف عن اعتقال خلية في دورة transfected خلايا الشبكية مع الجينات حتى عندما فاق عدد كبير من الخلايا untransfected في الثقافة نفسها. هذه الأمثلة توضح العديد من الطرق التي الحمض النووي وتلطيخويمكن استخدام التدفق الخلوي وتكييفها للتحقيق في المسائل الأساسية للسيطرة دورة الخلية الثديية.
Protocol
1. وضع العلامات وتحديد الخلايا
- إضافة 1 ميكرولتر من تكاثر الخلايا وصفها الكاشف (BrdU) لكل مليلتر من مستنبت الخلية ساعة 1 (1-1000 تمييع) قبل الحصاد. قد تحتاج إلى فترة الوسم بإطالة للخلايا أبطأ النمو.
- مخزنة على الخلايا الحصاد ، مستنبت نضح ويغسل جيدا مع الفوسفات الملحي (PBS). كرر لإزالة آثار بدقة متوسطة.
- يغسل الثقافات بسرعة للمرة الثالثة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على EDTA 3mM ونضح بدقة.
- إضافة كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني يحتوي على EDTA 3mm ل كل طبق ، و 0.5 مل لطبق 6 سم مثالية. احتضان عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا لفصل الخلايا. نقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- خلايا الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق لبيليه ، وإزالة طاف ، وresuspend جيدا في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
- إصلاح الخلايا من خلال إضافة 5 مل من 95 ٪ EtOH ، قطرة قطرة ، في حين vortexing. في هذه الخطوة ، يمكن تخزين الخلايا في 4 درجات مئوية عن ما لا يقل عنالشهر.
2. وتغيير طبيعة تلون BrdU والحمض النووي
- خلايا الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا بيليه وEtOH 95 ٪. Resuspend في 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 2N و 0.5 ٪ TX - 100 وذلك بإضافة بطريقة حكيمة في حين تراجع vortexing. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي كما كان من قبل في القسم 2.1 ونضح بعناية طاف منذ تشكيل خلايا بيليه فضفاضة جدا في هذه الخطوة. resuspend برفق في 1 مل من 0.1M 4 NAB O 7 (الرقم الهيدروجيني 8.5) وحضنت لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- المخفف الخلايا بيليه على النحو الوارد أعلاه في القسم 2.1 و 0.5 في resuspend مل من محلول الأجسام المضادة (PBS تحتوي على 1 ٪ BSA و 0.2 ٪ توين - 20) مع أضداد BrdU الماوس 1-50. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- خلايا بيليه مجددا وresuspend في 50 مل من محلول يحتوي على الأجسام المضادة لمكافحة الأرانب الماوس الأضداد الثانوية مترافق لFITC المخفف من 1 الى 25 احتضان لمدة 30 دقيقة علىالفوق وحمايتها من الضوء.
- خلايا الطرد المركزي ومرة أخيرة في resuspend 0.5 مل من يوديد propidium وريبونوكلياز الحل (PI - ريبونوكلياز الحل ، برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪ ، 10 يوديد propidium ملغ / مل ، 0.25 ملغ / مل وريبونوكلياز) ، ويحضن في الظلام في 37 ° مئوية لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك يمكن هضمها RNA بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام.
- الحل يمر عبر مصفاة لإزالة الركام الخلية وجمع الخلايا واحد في أنبوب المناسبة لامتصاص العينة على تدفق عداد الكريات الخاص. مرة أخرى ، يجب أن تكون محمية عينات من التعرض المباشر للضوء.
3. التحليل التدفق الخلوي
- وينبغي تحليل الخلايا عن طريق تدفق عداد الكريات القياسية التي هو قادر على التمييز ضد doublets (اثنان من الخلايا التي تمر من خلال تدفق خلية واحدة) مع القدرة على الكشف المناسبة ليوديد propidium وFITC. ويمكن الكشف عن خلايا واحدة في تطبيق هذا التدفق الخلوي التي تبوب للأحداث يستند إلى الأمام والجانب مبعثر البوب مبعثرulations ، وباستخدام خصائص الحمض النووي عن طريق تلطيخ يوديد propidium. مظهر من مؤامرة نقطة تميز مزدوجة يتراوح بين cytometers تدفق وتعتمد على الخصائص propidium تلطيخ يوديد ، راجع والتدفق الخلوي مرفق المحلية للحصول على المشورة حول اقامة الممي مزدوجة في تحليلك. بشكل عام ، وذلك في تكاثر السكان بشكل متزامن من الخلايا ، والخلايا واحد وعادة ما تكون القمم هما الأكثر وفرة (2N 4N والحمض النووي) في المؤامرة على التمييز صدرة وينبغي استخلاص الدروس من بوابة حولهم. هذا سوف حدد خلية واحدة الأحداث التي يتم استخدامها لتحليل كل اللاحقة أدناه.
- ينبغي للأول عينة لتحليلها تكون الثقافة المنتشرة بشكل غير متزامن التي هي بمثابة السيطرة إيجابية لتلطيخ وتدفق عداد الكريات انشاء. ضبط حساسية أنابيب مضخم لتلطيخ يوديد propidium بحيث تتركز القمم 2N 4N من الخلايا والقميص ب 200 و 400 (وحدات التعسفي) على محور X. نحن غالبا ما يكون وصمة عار ليالي وفيرةupply من هذه الخلايا لضمان أن تم تعديل جميع المعلمات من تدفق عداد الكريات بشكل مناسب دون استخدام هذه العينة. هذا التحكم الإيجابي هو أيضا مفيدة للمستخدمين الجدد ليصبحوا أكثر إلماما تشغيل عداد الكريات التدفق.
- ضبط حساسية أنبوب مضخم للكشف عن مثل هذه FITC G1 و G2 / M السكان هم فوق الخلفية. وينبغي أن تكون إيجابية الخلايا BrdU ما يقرب من 10 مرات أكثر إشراقا ، وينبغي أن يتم عرض العمودي ومقياس لوغاريتمي. ومن المفيد في بعض الأحيان لتشمل السيطرة السلبية لتلطيخ BrdU (بالاستعاضة عن أضداد BrdU مع المنظمات غير محددة في خطوة مفتش 2.3 أعلاه) لتميز بوضوح الخلايا الملون بشكل إيجابي.
- ضبط التعويض بين يوديد propidium وFITC مثل هذه الأحداث واحدة استولت عليها تدفق عداد الكريات شكل قوس على شكل حذاء الحصان من G1 في الطبقة السفلى من اليسار إلى S - المرحلة وهبوطا في أسفل اليمين لG2 / م. الرجاء مراجعة المرجع التالية للحصول على مزيد من العمق في ديسcussion لمبادئ واستخدام التدفق الخلوي والمراجع هناك في لتطبيقات محددة 2.
4. تحليل البيانات
- وينبغي جمع 5 000-10 الأحداث 000 خلية واحدة مع مجموعة المحتوى المطلوب لكل عينة الحمض النووي من أجل الحصول على الثقة التي تم السكان من الخلايا في الثقافة العينة بدقة.
- مرة واحدة وقد تم قياس خلايا يوديد propidium والمحتوى BrdU يحتاجون إلى أن تسند إلى مراحل G1 ، S ، أو G2 / M. القيام بذلك عن طريق الرسم حول بوابات السكان BrdU السلبيتين تركزت في 200 و 400 (G1 و G2 / M على التوالي). وينبغي أن تدرج كل شيء فوق هذه الصناديق في بوابة واحدة أن التدابير S - المرحلة (الشكل 1A). النسبة المئوية للخلايا في كل باب يمثل العدد النسبي للخلايا في G1 ، S ، وG2 / M (الشكل 1B).
5. بروتوكول بديل لتحليل دورة الخلية في يسكنها خليط من الخلايا
- هذا البروتوكول هو البديلمفيدة للغاية عندما ترنسفكأيشن ناقلات النتائج التعبير بشكل روتيني في نسبة منخفضة من خلايا التعبير عن الجين المنتج من الفائدة ، أو عند العلاج الدوائي لتحديد السكان نقية من خلايا غير عملي. untransduced هذه النتائج في نسبة صغيرة نسبيا من الخلايا ذات الاهتمام تلوثها مع عدد كبير من الخلايا. في هذه الحالة ، وشارك في التعبير عن الجينات transfect البلازميدات أو shRNA الاهتمام جنبا الى جنب مع البلازميد التي تعبر عن علامة للكشف عن الخلايا التي transfected التدفق الخلوي ، مثل غشاء الراسية GFP 3 ، أو سطح الخلية علامة أجنبية مثل 4 أو CD19 5 CD20.
- لأغراض هذا البروتوكول سوف نستخدم CD20 تلطيخ كمثال على ذلك ، ومع ذلك ، وتلطيخ لCD19 متطابقة في جوهرها. في حالة ترنسفكأيشن مع CD20 ، ليست هناك حاجة لتسمية BrdU ، حصاد الخلايا ببساطة كما هو موضح في الخطوات 1،2-1،5 أعلاه وصمة عار وذلك بإضافة 20 FITC مترافق ميكرولتر مكافحة CD20 الأجسام المضادة لخلايا على طم لمدة 20 دقيقة في الظلام. إصلاح الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.6. مرة أخرى يمكن أن يتم تخزين الخلايا لمدة شهر على الاقل في 4 درجات مئوية في الظلام. للكشف عن GFP ، بحذف تلطيخ الضد من هذه الخطوة والإصلاح وتخزين الخلايا كما هو موضح.
- إعادة ترطيب الخلايا التكوير في اجهزة الطرد المركزي في 500 XG لمدة 5 دقائق وإعادة التعليق في 5 مل من برنامج تلفزيوني يتضمن BSA 1 ٪.
- إعادة بيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق وخلايا resuspend في 0.5 مل من يوديد propidium ريبونوكلياز والحل كما هو موضح أعلاه في القسم 2.5.
- تواصل اتباع تعليمات إعداد خلية في 2.6 و تحليل تعليمات في 3.1 و 3.2.
- ضبط حساسية أنبوب مضخم للكشف عن مثل هذه FITC أن الخلايا غير ملوثين هي فوق الخلفية. من الناحية المثالية ، فإن خلايا CD20 - FITC إيجابية لتكون ملطخة 10X 100X بشكل مكثف أكثر من الخلفية ، وينبغي أن يتم عرض Y - محور هذه المؤامرة بمثابة مقياس لوغاريتمي (الشكل 2A). خلايا CD20 الإيجابية التي هي أكثر إشراقا من 10X backgيجب أن يتم تحديد الدور (وتلطيخ مع يوديد propidium بين 200 و 400) للعرض في يوديد propidium مقابل تعداد خلايا الرسم البياني كما هو موضح في الشكل. 2C. للخطوط الخلايا التي تعبر عن العلامات التي يتم بسهولة الملون بألوان زاهية (أي. 10X 100X أعلاه إلى الخلفية) يجب تعيين CD20 الإيجابية قطع في الخلفية 10X. إدراج الخلايا الضعيفة تلطيخ يزيد التباين في هذه التجارب ، ويفترض انه بسبب ان هذا الجين أيضا الاهتمام أعرب ضعيف في هذه الخلايا. وينبغي لخطوط الخلية التي تسفر سوى ملطخة ضعيفة CD20 ايجابيات (أي أقل من الخلفية 10X) ، يتم تحديد لوقف إنتاج المواد الانشطارية باستخدام السيطرة السلبية التي تتكون من خلايا CD20 ملون untransfected.
- وينبغي جمع ما لا يقل عن 1000 CD20 الأحداث الإيجابية لكل عينة. والتجارب مع أحداث 1000 التي تنتج أقل من تقلبات عالية. حزم البرمجيات مثل LT ModFit (فيرتي برامج) ، موضوع AV دورة (فينيكس نظم التدفق) ، وتدفق جو (شجرة نجوم) استخدام التقديرات الرياضيةالسكان G1 ، S ، وG2 / M التي تساهم في شكل المنحنى في المدرج الاحصائي ، مثل تلك التي تظهر في الشكل. 2B وجيم.
6. ممثل النتائج :
ونحن نقدم ثلاثة أمثلة من التحليلات التجريبية دورة الخلية باستخدام نهجنا. أول تعبير يستخدم للفيروسات تعتمد cyclin مثبط كيناز p27KIP1 في الخلايا الليفية الماوس الجنينية. اربع وعشرين ساعة بعد اختيار الدواء لعدوى فيروسية كان كاملا ، وكانت الخلايا المسمى مع نبض BrdU لمدة ساعة. في هذه التجربة تم استخدام التعبير خارج الرحم من مثبط للقبض على انتشار الخلايا (الشكل 3A وباء). كما هو مبين في الشكل. 3B قليلا الأحداث BrdU إيجابية واضحة في البوابة S - المرحلة استجابة لP27. وبالمثل ، فإن النسبة المئوية للخلايا في مرحلة لP27 - S التعبير عن الخلايا منخفضة جدا كما في الشكل diagramed. 3C. وقد كان هذا النوع من التحليل فعالة جدا في تشخيص عيوب الخلية دورة التحكم في الخلايا المشتقة من سلالات مختلفة من زإيني استهداف الفئران 6 ، 7 ، 8.
في التجربة الثانية ، تم علاج الخلايا الظهارية untransformed الثديية (MCF10A) مع خلوى النمو المثبطة ، وتحويل عامل النمو بيتا واحد (TGF - β1) لمدة 24 ساعة. وصفت الخلايا مع BrdU لمدة أربع ساعات مباشرة قبل الحصاد. كما هو مبين في الشكل. تتقلص بشكل كبير في وسم 4 BrdU S - المرحلة الخلايا TGF - β1 الإشارة ، كما يتم التحقق من صحة خصوصية تلطيخ لدينا مع مراقبة مفتش السلبية (الشكل 4C). الكمي لمراحل مختلفة من دورة الخلية يؤكد أن β1 TGF - يمنع انتشار في المقام الأول في المرحلة G1 من دورة الخلية ، مما يؤدي إلى تراكم في هذه المرحلة.
في مثالنا الأخير ، هي ناقصة transfected PRB SaOS - 2 الخلايا مع ناقلات CMV - CD20 التعبير وإما CMV - RB أو CMV - β - غال كمجموعة تحكم. كانت تحصد ثلاثة أيام في أعقاب الخلايا ترنسفكأيشن ، الملون ، والثابتة. تحليل التدفق الخلوي لهذه الخليةهو مبين في الشكل ق. 5. هذا يدل على توزيع دورة الخلية من الخلايا السيطرة السلبية transfected (الشكل 5A) مقارنة مع التوزيع التالي 72 ساعة من التعبير PRB (الشكل 5B). بعد تركيب المنحنى بواسطة برنامج دورة موضوع ، تظهر المقارنة المباشرة لنسبة مراحل دورة الخلية في الشكل. 5C. هذا يكشف عن تراكم الخلايا في التعبير G1 PRB التالية واستنفاد النسبية للخلايا من مراحل S و G2 / M. لقد اعتدنا على هذه الاختلافات ، لبحث آليات الفحص القبض على نطاق واسع G1 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13.
هذه الأمثلة توضح كيف يمكن قياس السيطرة دورة الخلية في الاستجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات أو التلاعب الخلية. ويمكن بالتالي هذا النهج أن تتكيف مع العديد من التطبيقات التي تتطلب قياس موقف دورة الخلية في التجارب نوع الثقافة.
الشكل 1. Quantitالنسبة من مراحل دورة الخلية التي يوديد propidium مجتمعة ، وتلطيخ BrdU (PI - BrdU). (أ) هذه اللوحة تعرض ثلاثة التدفق الخلوي الأبعاد من يوديد propidium والخلايا BrdU الملون. علما بأن تتركز خلايا الحمض النووي مع محتوى 2N و4N على علامات 200 و 400 على مقياس المحور السيني ليوديد propidium شدة التلوين. ويتم قياس كثافة BrdU تلطيخ على مقياس لوغاريتمي على محور Y. لاحظ موقف البوابات المستخدمة لquantitate الخلايا في مراحل G1 ، S ، وG2 / M من دورة الخلية. (ب) وتظهر الحصة النسبية من الخلايا في كل من بوابات G1 ، S ، وG2 / M من A على هذا الرسم البياني.
الشكل 2. الكميات من مراحل دورة الخلية في الخلايا المحددة باستخدام يوديد propidium وعلامة السطحية CD20 الخلية. (أ) هذه اللوحة يظهر يوديد propidium CD20 وتلطيخ لمزيج من الخلايا ، التي تعبر عن بعض وPRB ectopically CD20. لاحظ أن الخلايا التي تحتوي علىوتتركز 2N 4N الحمض النووي (السكان الأكثر وفرة) على علامات 200 و 400 على محور X. موقف بوابة CD20 + الخلايا التي يتم تحديد ما لا يقل عن 10X الملون بألوان زاهية أكثر من الخلفية. (ب) ويبين الرسم البياني لعدد الخلايا مقابل تلطيخ يوديد propidium لخلايا CD20 السلبية في لوحة والتي تنتشر بشكل متزامن. (C) ويظهر رسم بياني مشابه للخلايا CD20 إيجابي من لوحة والتي تم إلقاء القبض يسببها مع التعبير PRB وتحتوي على خلايا الحمض النووي مع محتوى 2N في المقام الأول. هذا يدل على أن يمكن تمييزها an القبض الفرعي السكان من الخلايا الأخرى في هذه الثقافة باستخدام هذه التقنية تلطيخ.
الشكل 3. تثبيط تكاثر الخلايا التي p27KIP1. (أ) يستخدم PI - BrdU تحليل لقياس مراحل دورة الخلية في التكاثر السكاني بشكل متزامن من الخلايا التي تم transduced مع vecto فارغة فيروسات pBABEر. (ب) transduced تحليل مماثل من الخلايا مع pBABE - P27. لاحظ عدم وجود خلايا في مرحلة - S ، وزيادة كثافة الأحداث في G1 وبوابات G2 / M. (ج) الكميات من الخلايا في كل من مراحل دورة الخلية تتكاثر بشكل غير متزامن في الرقابة والتعبير عن الخلايا P27.
الشكل 4. تثبيط تكاثر الخلايا التي β1 TGF - (A) PI - BrdU تحليل الخلايا المتكاثرة بشكل غير متزامن MCF10A. (ب) تحليل الخلايا المعالجة مع 100 من مساء TGF - β1 لمدة 24 ساعة. لاحظ تراكم الخلايا في المقام الأول في المرحلة G1 من دورة الخلية. (ج) التحقق من صحة تلطيخ BrdU بالاستعاضة عن الأضداد المضادة للBrdU الأولية مع مفتش الرقابة غير محددة في الخلايا المتكاثرة بشكل غير متزامن. (د) الكميات الرسومية من مراحل دورة الخلية من كل ألف وباء.
الشكل 5. تثبيط تكاثر الخلايا التي PRB. (A) ويرد التهم خلية مقابل تلطيخ يوديد propidium من CD20 وخلايا بيتا transfected غال. هذا هو المهم السيطرة على ترنسفكأيشن يمكن مزامنة جزئيا الخلايا ، مما يجعل السكان untransfected (CD20 -- الخلايا) كعنصر تحكم غير مناسب لtransfected الفرعي السكان. Transfected الخلايا تحتاج إلى مقارنة مع غيرها من الخلايا transfected بالقياس. (ب) عدد الخلايا مقابل propidium الرسم البياني من يوديد CD20 وPRB transfected الخلايا. لاحظ وجود حصرية تقريبا من ذروة 2N. (C) التمثيل البياني للأبعاد الخلية مرحلة دورة تحديدها من ألف وباء واستخدام أساليب منحنى المناسب في دورة البرامج المتعددة.
Discussion
في تجربتنا ، والنجاح مع هذه التقنيات تعتمد على مفتاح التحكم قليلة والظروف التجريبية. واحد هو إقامة سيطرة المتكاثرة بشكل غير متزامن لاستخدامها في هذه التجارب. هذه السيطرة يخدم ثلاثة أغراض هامة. الأولى ، فإنه يضمن ظروف ثقافة المستخدمة لجميع العينات التجريبية هي كافية لدعم الانتشار المتواصل في غياب العلاج. هذه العينة أيضا يخدم الغرض من مراقبة إيجابية لتلطيخ منهجية لضمان أن يتم الكشف عن خلايا CD20 BrdU أو إيجابية عندما كانت موجودة. أخيرا ، يتم استخدام هذه العينة لمعايرة عداد الكريات التدفق. ويمكن استخدام هذا النموذج التحكم لضبط شدة propidium تلطيخ يوديد للكشف عن خلايا 2N و4N في 200 و 400 على التوالي. وعلاوة على ذلك ، يمكن ضبط حساسية الكشف عن BrdU أو CD20 بحيث تتركز إشارات سلبية وإيجابية كما هو مبين في الأرقام و1A 2A. عندما يكون جميع العينات تركزا مماثلا من الخلايا في PI - RNase الحل ، ثم هناك حاجة إلى بعض التعديلات في عداد الكريات كما يتم تشغيل عينات لاحقة. هذا مهم لأسباب المبينة في الشكل. 4B 5B وقوية حيث تراكم يخلق أساسا G1 G1 ذروة واحدة يمكن ان يساء تفسيرها على أنها G2 / م.
التجارب أيضا جعل ممثل نقطة هامة أخرى. بادئ ذي بدء ، فإنها تثبت أن BrdU امتصاص ووضع العلامات يمكن أن تتفاوت بين أنواع الخلايا. لهذا السبب من المهم تجريبيا لتحديد طول النبض والشروط اللازمة للكشف عن تلطيخ الخلايا على نحو كاف في S - المرحلة. عموما ، يمكن أن توصف أنواع الخلايا التي مزدوجة في الثقافة في 24 ساعة أو أقل مع BrdU في ساعة واحدة. قد أبطأ أنواع الخلايا المتزايدة تتطلب تعد البقول وتعديلات على الشروط تلوين الأجسام المضادة ومدتها. خلايا MCF10A هي مثال ممتاز في هذا الصدد كما وصفت لهم BrdU لمدة أربع ساعات والملون مع التركيز على ضعف مستوى الأجسام المضادة لمدة أربعة أضعاف طويلة. محققونيجب أن نكون حذرين بحيث لا يتجاوز 6 ساعات من وضع العلامات BrdU حتى مع تزايد الخلايا ببطء شديد لأن ذلك يمكن أن يؤدي خطأ إلى إدراج G2 / M الخلايا في السكان S - المرحلة. ثانيا ، في المقارنة بين آثار p27KIP1 التعبير مع تلك TGF - β1 ، فمن الواضح أن P27 يمكن أن تحدث في أي تراكم أو المراحل G1 G2 / M - β1 TGF بينما يشير يؤدي الى اعتقال G1. الوسائل التقليدية للكشف عن انتشار مثل إدماج H - 3 ثيميدين والتلألؤ عد غير قادر على التمييز بين هذه الاحتمالات.
في بروتوكول لدينا بديل نظهر للكشف عن مجموعة من السكان فرعية من الخلايا في عدد السكان أكبر untransfected. من المهم تحديد تجريبيا الصحفي الأكثر ملاءمة للكشف عن خلايا transfected. تجربتنا في بعض أنواع الخلايا إما عن سطح الخلية علامات سيئة ، أو لا يمكن المرور عليها بشكل صحيح إلى غشاء البلازما ، مما أدى إلى عدم القدرة على الكشف عن خلايا transfected. Likewise ، وليس كل الخلايا تحمل شكل غشاء ملزمة للGFP. وينبغي أن يتم الاختيار لمراسل أنسب من خلال تقييم كفاءة ترنسفكأيشن لمراسل وكذلك الكثافة النسبية للتعبير مقارنة مع الضوابط untransfected. من الناحية المثالية ، سيتم تعبير مغايرة لهذه الجزيئات جيد التحمل ، وهذا يوحي بأن ليس لديهم علامات على أي تأثير على توزيع دورة الخلية.
القيد واحد من هذه الأنواع من نهج التدفق الخلوي هو أنها الوحيدة القادرة على وضع فرة نسبية من مراحل دورة الخلية مقارنة مع بعضها البعض. لهذا السبب فهو تعبير عن حالة غامضة P27 في الشكل 3 يدفع حقا الاعتقال في G1 و G2 / M ، أو إذا كان مجرد يبطئ تقدم من خلال هذه المراحل بالنسبة إلى S - المرحلة. ويمكن تحقيق المزيد من هذه الاحتمالات من خلال معالجة عينة من الخلايا المتوازية مع مثبط الإنقسامية مثل nocodazole ، أو G1 / S مثبط مثل aphidicolin. منذ إنشاء هذه الأدوية دوميناNT الاعتقال في المرحلة M - S - أو أوائل مرحلة على التوالي ، وسوف تتراكم ببطء الخلايا المتكاثرة في اعتقال نقطة المخدرات التي يسببها. لسوف الخلايا سبيل المثال ألقي القبض عليه في G1 بسبب التعبير PRB البقاء في G1 على الرغم من العلاج في حين أن الخلايا nocodazole السيطرة سوف تتراكم في المرحلة M - 13.
أخذت معا ، وهذه المناهج التجريبية تقترح منهجية مرنة يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة أبحاث الخلايا الثديية دورة. فإنها يمكن بسهولة اكتشاف تغيرات في تطور دورة الخلية وتحديد الاختلافات عند مقارنة مع الضوابط.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نشكر المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) وجمعية السرطان الكندية للحصول على تمويل أبحاث الخلايا دورة في المختبرات الخاصة بهم. MJC هي المستفيدة من منحة MD / دكتوراه من CIHR. MJC والماجستير هي أعضاء في برنامج التدريب CaRTT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Proliferation Labeling reagent | GE Healthcare | RPN201 | |
| Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Laboratories | FI-2000 | |
| Cell Strain Filters | BD Biosciences | 352235 | |
| Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
| Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |
References
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).
- Givan, A. L.
- Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry. J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).
- Qin, X. -Q. The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action. Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, 2050-2050 ( ).
- Henley, S. A. A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions. Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).
- Francis, S. M. A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development. Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).
- Isaac, C. E. The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin. Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).
- Julian, L. M. Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation. Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).
- Hirschi, A. An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).
- Dick, F. A., Dyson, N. pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities. Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).
- Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins. Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).
- Dick, F. A., Dyson, N. J. Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins. J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).
