粘附频率检测,用于测量当两个分子相互作用的细胞表面锚定受体 – 配体相互作用的动力学描述。使用一个微管加压作为粘附传感器的人体红血细胞和整合αLβ2和细胞间粘附分子-1受体和配体相互作用,这种机械为基础的检测例证。
微管黏附实验是在1998年开发的,衡量的二维(2D)受体-配体结合动力学。检测使用传感器粘附细胞相互作用的分子之一,并提出一个人的红细胞(RBC)的。它采用显微操作与另一个细胞的表达与精确控制的区域和时间,使债券形成的其他相互作用的分子接触,使红细胞。红细胞伸长后发现,除了拉动两个细胞黏附事件。通过控制固定的红细胞表面上的配体的密度,粘连的概率保持在0和1之间的中档。粘连的概率估计在两个细胞之间的一个给定的接触时间的反复接触,周期序列的粘附事件的频率。不同的接触时间,产生一个具有约束力的曲线。拟合概率模型的结合受体-配体反应动力学1曲线返回2D的亲和力和关闭率。
该试剂盒已通过验证,使用与IgG的Fc 段 1-6,选择素与糖缀合物的配体6-9,与配体10-13 homotypical cadherin 的约束力14,T细胞受体与辅助受体肽主要组织相容性复合物15整合Fcγ 受体的相互作用- 19。
该方法已用于生物物理因素,如膜microtopology 5,膜锚2,分子取向和长度为6,承运人刚度9,曲率20,和撞击力20,以及生化因素,量化的二维动力学的规定,如调制的骨架和膜的微环境相互作用的分子, 这些分子表面,15,17,19组织。
该方法也被用来吨Ø研究并发约束力的双种受体-配体3,4,和19三分子相互作用使用修改后的模型 21 。
该方法的主要优点是,它允许在他们的母语膜环境受体的研究。结果可能会非常不同,从获得使用纯化的受体 17 。它还允许在时间分辨率,远远超出了典型的生化方法分一秒的时间尺度的受体 – 配体相互作用的研究。
要说明的微量粘附频率的方法,我们动力学测量间粘附分子-1(ICAM – 1)红细胞约束力的解决方案中的E -选择与二聚体的中性粒细胞激活α大号β2整合素α大号β2功能。
要成功使用微管粘附频率检测应考虑的几个关键步骤。首先,确保记录的具体利益的受体 – 配体系统的相互作用。非特异性控制测量(参见图3,4)保证的特殊性。理想的情况下,非特异性黏附概率应低于0.05,对所有接触的时间段,每个时间点之间的特异性和非特异性黏附概率有显著差异。不同的方法可以用来夫妇的红细胞表面的配体。结果表明,氯化铬耦合方法17了非特异性结合的生物…
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由NIH的拨款R01HL091020,R01HL093723,R01AI077343,并R01GM096187支持。
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |