Summary
يوصف لفحص لقياس التردد التصاق حركية التفاعل مستقبلات يجند عندما ترسو على حد سواء الجزيئات على أسطح الخلايا المتفاعلة. ويتمثل هذا الاختبار القائم على ميكانيكيا باستخدام micropipette مضغوطة الإنسان خلايا الدم الحمراء وأجهزة الاستشعار والتصاق αLβ2 إنتغرين وبين الخلايا جزيء التصاق - 1 والتفاعل ومستقبلات يغاندس.
Abstract
تم تطوير مقايسة التصاق micropipette في عام 1998 لقياس ثنائي الأبعاد (2D) مستقبلات يجند حركية ملزمة 1. في مقايسة يستخدم الإنسان خلايا الدم الحمراء (RBC) وأجهزة الاستشعار والتصاق الخلية عرض لواحدة من الجزيئات المتفاعلة. انها توظف المجهرية لجلب RBC في اتصال مع خلية أخرى يعبر عن جزيء التفاعل مع غيرها من المنطقة التي تسيطر على وجه التحديد والوقت لتمكين تشكيل السندات. تم الكشف عن حالة التصاق والاستطالة على سحب RBC الخلايا باستثناء اثنين. من خلال التحكم في كثافة يغاندس ثبتوا على سطح خلايا الدم الحمراء ، يتم الاحتفاظ احتمال الالتصاق في منتصف المدى بين 0 و 1. ويقدر احتمال التصاق من وتيرة الأحداث التصاق في سلسلة من دورات متكررة الاتصال بين خليتين لوقت الاتصال معين. متفاوتة في وقت الاتصال يولد منحنى ملزم. تركيب نموذج احتمالي لمستقبلات يجند رد فعل حركية 1 إلى الربطمنحنى عائدات تقارب معدل 2D وقبالة.
وقد تم التحقق من صحة الفحص باستخدام تفاعلات مستقبلات Fcγ مع نادي مفتش 1-6 و selectins مع يغاندس glycoconjugate 6-9 ، لل integrins مع يغاندس 10-13 ، homotypical كادهيرين ملزمة 14 ، تي مستقبلات الخلية وcoreceptor مع المجمعات الكبرى التوافق النسيجي الببتيد - 15 -- 19.
وقد استخدمت هذه الطريقة لقياس أنظمة حركية 2D عوامل البيولوجية والفيزيائية ، مثل الغشاء microtopology 5 ، 2 مرساة الغشاء ، والتوجه الجزيئية وطول 6 ، وتصلب الناقل 9 ، 20 انحناء ، وقوة اعتداءات 20 ، فضلا عن العوامل البيوكيميائية ، مثل جهري من الهيكل الخلوي والغشاء المكروية حيث تتفاعل الجزيئات الموجودة وتنظيم سطح هذه الجزيئات 15،17،19.
الأسلوب كما استخدمت رس دراسة الربط المتزامن لأنواع مستقبلات يجند 3،4 المزدوج ، والتفاعلات trimolecular 19 باستخدام نموذج تعديل 21.
والميزة الرئيسية لهذه الطريقة أنها تسمح دراسة المستقبلات في غشاء بيئتها الأصلية. ويمكن أن تكون النتائج مختلفة جدا عن تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مستقبلات المنقى 17. كما يسمح دراسة التفاعلات مستقبلات يجند في فترة زمنية الفرعي الثاني للقرار الزمنية إلى ما وراء الأساليب التقليدية البيوكيميائية.
لتوضيح طريقة التصاق micropipette التردد ، وتبين لنا قياس حركية جزيء التصاق بين الخلايا 1 (ICAM - 1) على كرات الدم الحمراء functionalized ملزمة لإنتغرين β α L 2 على العدلات مع مثنوي E - selectin في الحل لتنشيط β α L 2.
Protocol
1. كرات الدم الحمراء في الدم من عزلة كاملة
- تعد قمة شرق اسيا حلول - 45. يصل وزنه جميع المكونات من الجدول الأول وتذوب في 200ml من الماء - 100 DI. إضافة الماء لجعل الحل وضبط درجة الحموضة 1000ml إلى 8.0. تصفية وقسامة بواسطة 50ml. التجميد في -20 درجة مئوية لمدة التخزين.
ملاحظة : يجب أن يتم تنفيذ الخطوة 1.2 من هذا القبيل تدريب المهني الطبي كممرضة ، مع مجلس المراجعة المؤسساتي البروتوكول المعتمدة.
- التعادل 3 - 5ml من الدم من الوريد المرفقي المتوسط في أنبوب EDTA 10ML تحتوي على مزيج بلطف والدم مع EDTA فورا وبدقة لتجنب تجلط.
- عملية عينة الدم في أقرب وقت ممكن. وينبغي القيام بكل الخطوات التالية ما عدا الطرد المركزي تحت غطاء محرك السيارة للحفاظ على إعداد عقيمة. نقل الدم إلى أنبوب الطرد المركزي 50ml ، إضافة 10ML Histopaque من البرد ومعقمة و1077 جهاز طرد مركزي ل5min @ 1000rpm ، 4 درجات مئوية. كرر مرتين.
- إضافة 10مل الباردة ومعقمة PBS ، الطرد المركزي ل5min @ 1000rpm ، 4 درجات مئوية. إزالة طاف. كرر 4 مرات (المجموع 5 مرات).
- تغسل مع العقيمة EAS - 45 (درجة مئوية 5min @ 1000rpm ، 4) مرتين. خلال مشاركة كرات الدم الحمراء نقل الغسيل في أنبوب جديد 15ml العقيمة.
- Resuspend كرات الدم الحمراء in10ml EAS - 45.
2. كرات الدم الحمراء biotinylation
- أخذ أنبوب مع كرات الدم الحمراء من الخطوة 1. إزالة كافة طاف بعد الطرد المركزي ل5min @ 1000rpm ، 4 درجات مئوية. وضع بيليه 10μl من كرات الدم الحمراء لكل من عدة قوارير وإضافة مبلغ مماثل لبرنامج تلفزيوني على كل قارورة (انظر الجدول الثاني على سبيل المثال إعداد تركيزات مختلفة من ستة biotinylation كرات الدم الحمراء).
- جعل الطازجة Biotin-X-NHS/DMF 1:10 ، 1:100 التخفيفات حسب الجدول الثاني.
- إضافة 10μl العازلة من بورات 0.1M إلى كل القارورة.
- إضافة كمية محسوبة من البيوتين إلى حل كل قارورة (انظر الجدول الثاني على سبيل المثال) ، ودوامة على الفور.
- وضع كل قارورة RBCداخل أنبوب 50ml المخروطية وعلى احتضان المدورة ل30min في درجة حرارة الغرفة.
- غسل القنينة الواحدة 3 مرات مع 800μl من EAS - 45 لل2000rpm @ 2min.
- إضافة 100μl من EAS - 45 على كل قارورة وتخزينها في 4 درجات مئوية. في كل 1μl الحل النهائي يجب أن يكون الآن ~ 1mln من كرات الدم الحمراء.
3. * في Functionalizing يغاندس البيوتين مرتبطة على كرات الدم الحمراء
- إعداد 2mg/ml streptavidin حل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. قد تكون مخزنة في حل Aliqouted -20 درجة مئوية.
- مزيج مبلغ مساو من كرات الدم الحمراء من الخطوة 2.7 (10μl) مع الحل streptavidin ، دوامة فورا وعلى احتضان المدورة ل30min عند 4 درجة مئوية.
- يغسل 3 مرات مع 500μl من EAS - 45 لل2000rpm @ 2min. إضافة 15μl EAS - 45 / 1 ٪ BSA للتخزين.
- المزيج كمية مساوية من كرات الدم الحمراء من الخطوة 3.3 (10μl) مع الحل يجند 20μg/ml ، دوامة فورا وعلى احتضان المدورة ل30min في درجة حرارة الغرفة.
- تغسل مرتين مع 500μl من EAS -45 / 1 ٪ لجيش صرب البوسنة 2min @ 2000rpm. إضافة 15μl من EAS BSA - 45 / 1 ٪ للتخزين.
* إذا كان لديك بروتين لا يوجد لديه ارتباط البيوتين يمكنك استخدام واحدة من مجموعات المتاحة تجاريا لbiotinylation البروتين (على سبيل المثال ، الحرارية العلمية # 21955 EZ - ارتباط مايكرو NHS - PEG4 - Biotinylation كيت) أو استخدام الأضداد biotinylated اسر بمثابة خطوة وسيطة كما هو موضح في شريط الفيديو.
4. الكمي للكثافة المستقبلات ويجند
- احتضان يجند المغلفة كرات الدم الحمراء من الخطوة 3 ، وقارورة في الخلايا مستقبلات مختلفة الحاملة ، مع تركيزات تشبع من MABS منها ل30min في درجة حرارة الغرفة. احتضان في خلايا منفصلة مع قارورة الأضداد isotype المطابقة غير ذات صلة من أجل السيطرة. إذا لم يتم الأجسام المضادة الأولية fluorescently المسمى ، مع احتضان الأضداد الثانوية fluorescently ، مترافق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تحليل عينات أعدت في الخطوة 4.1 cytometery التي تتدفق مع كال الفلورسنت المقابلةibration الخرز. حساب الكثافة كما هو مبين في الشكل. 1.
5. استعدادا لmicropipette وغرفة الخلية
- سحب micropipettes من الأنابيب الشعرية به PN - 30 Narishige 'بولير Microelectrode الزجاج الأفقي المغناطيسي أو آلات بولير Micropipette سوتر.
- مع استخدام micromanipulator microforge لضبط غيض من micropipette انسحبت إلى الحجم المطلوب (عادة يتراوح قطرها المطلوبة من 5μm - 1 اعتمادا على حجم الخلايا لاستخدامها في الدراسة).
- إعداد غرفة الخلية عن طريق قطع الزجاج غطاء مجهر إلى الحجم المطلوب. ختم الغرفة باستخدام الزيوت المعدنية من كلا الجانبين لتجنب التبخر المتوسطة لتغيير الأسمولية أثناء التجربة.
- إضافة مستقبلات الخلايا ويجند تحمل إلى الغرفة.
6. Micropipette مقايسة التصاق التردد
- نضح الخلايا التي تتفاعل الماصات منها واستخدام الكمبيوتر مبرمجة piezoelectr جيم مترجم لدفع RBC داخل وخارج الاتصال مع الخلايا الاخرى مع منطقة تسيطر عليها الاتصال والوقت. الكشف عن أحداث التصاق بملاحظة RBC استطالة عند انتهاء الخلية.
- تكرار دورة الاتصال ، 5-10 مرات التراجع عن وقت الاتصال معين. تسجيل الأحداث التي لاحظها التصاق مضيفا "1" للالتصاق أو "0" لا لالتصاق في عمود من جدول بيانات Excel. يمكنك استخدام جهاز التسجيل ، على سبيل المثال ، والإعلام الرقمي أو شريط فيديو ، للصور المجهرية.
- تسجيل الترددات التصاق مقابل منحنى الاتصال به مرة على الأقل ثلاثة أزواج مختلفة من الخلايا في كل مرة للحصول على اتصال ويعني SEM.
- سجل منحنى غير محدد ملزم للتحكم باستخدام كرات الدم الحمراء المغلفة مع يغاندس غير ذي صلة (على سبيل المثال BSA) و / أو إعاقة أو يغاندس المستقبلات الخاصة به MABS الحصار وظيفية. ويمكن حساب التردد التصاق محددة في كل وقت عن طريق نقطة اتصال وتيرة ازالة التصاق غير محدد 1.
- تتناسب وتيرة محددة التصاق ف وقت بيانات الاتصال طن مقابل من نموذج احتمالي (المعادلات 1) الذي يصف الدرجة الثانية إلى الأمام والنظام الأول العكسي ، خطوة واحدة التفاعل بين نوع واحد من المستقبلات ونوع واحد من يغاندس 1 :
حيث K أ هو 2D تقارب ملزمة فعالة ، ك قبالة هو إيقاف الصرف ، م ص و ل م هي مستقبلات منها وقياس كثافة يجند في الخطوة 4 ، وج هي منطقة الاتصال. منحنى تناسب معلمتين ، أ ج أ ك ك وخارجها ، كما ألف ج والبوتاسيوم وجمعها معا ، ودعا a مجتمعة تقارب 2D فعالة. منتجاتها مع معدل قبالة هو فعال على معدل 2D : A ج ك = A على ج س ك ك a قبالة.
ويتم احتساب وتيرة محددة التصاق ف ثانوي الطرح للالتصاق جزء غير محدد (ف غير محدد) من مجموع التصاق قياس (P تقاس) 1،21 :
8. ممثل النتائج :
الشكل 1 تحديد إنتغرين β α L 2 الكثافة موقع على العدلات. وحضنت first العدلات مع 1μg/ml من E - IG - selectin ل10min لتتناسب مع حالة التجريبية المستخدمة في أرقام 3،4 أو بدون E - IG - selectin ، ثم مع تركيزات تشبع (10μg/ml) من PE - مترافق المضادة البشرية CD11a خريطة موقع (استنساخ HI111 ، انظر جدول محددتغسل الكواشف والمعدات) أو غير ذات صلة IgG1 الماوس للسيطرة ، وتحليلها على الفور. وكانت العينات في قراءة عداد الكريات دينار بحريني مع تدفق LSR QuantiBRITE الخرز المعايرة القياسية PE. رسوم بيانية لوحة ويظهر مضان من الخرز المعايرة (الوردي) جنبا الى جنب مع تلك - E - selectin الإيج الخلايا المعالجة (اللون الأزرق) أو غير المعالجة (اللون الأخضر). ويرد محددة تلوين خريطة موقع CD11a في منحنيات الصلبة وغير ذي صلة الضد يظهر سيطرة isotype المطابقة تلطيخ في منحنيات المنقط. لم الخلايا تعامل مع E - IG - selectin (وجود في جميع الخطوات في الغسيل وFACS العازلة) لن يؤثر على كثافة CD11a كما يتضح من مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. لوحة باء يظهر في عملية تقدير الكثافة. وقد حسبت LOG10 لشدة يعني فلوري (FI) من كل قيمة الذروة أربعة رسوم بيانية المعايرة حبة من لوحة A (الدوائر الوردي) وجزيئات PE الكثير محددة لكل حبة (من الشركة المصنعة). والانحدار الخطي للجزيئات PE LOG10 لكل حبة ضد fluoresc LOG10وقد تآمر جزأين. لE - selectin الخلايا معاملة FI LOG10 (ذ) قيم المساواة 3.99 (دائرة زرقاء ثابتة) و2.23 (دائرة مفتوحة الأزرق) لخريطة موقع الضد محددة والسيطرة ، respectivly. علينا حل المعادلة الخطية ل x (يتم رسم القيم كدوائر خضراء وزرقاء على الفريق B) س = LOG10 PE / خلية ، وكما PE : خريطة موقع كانت نسبة 1:1 ، وكان العدد الإجمالي للβ α L 2 على العدلات المحسوبة على النحو 9587. تم حساب كثافة السطح لتكون جزيئات 43 / 2 ميكرون ، وذلك باستخدام 8.4μm كما قطرها 22 العدلة. وقد تم قياس كثافة بالمثل ICAM - 1 بواسطة cytometery تدفق باستخدام PE - المضادة للCD54 خريطة موقع الإنسان ، والتي بلغت 65 مول / 2 ميكرون.
الرقم 2 نظام Micropipette الخطط. تم تجميع نظامنا micropipette في المنزل ويتكون من ثلاثة نظم فرعية هي : فرعي التصوير للسماح واحد لمراقبة وتفصيلORD وتحليل تحركات الخلية micropipette - يستنشق ؛ فرعي المجهرية لتمكين احد لتحديد الخلايا من الغرفة الخلية ، والنظام الفرعي للسماح للضغط واحد إلى نضح الخلايا في micropipettes. غير مقلوب على جزء أساسي من النظام الفرعي التصوير المجهر (أوليمبوس IMT - 2 IMT2) مع الغمر النفط 100X الهدف NA 1.25. يتم إرسال صورة إلى مسجل فيديو كاسيت من خلال اتهام الزوجين جهاز (CCD) الكاميرا. ويقترن جهاز توقيت الفيديو إلى نظام لتتبع الوقت. ويمكن التلاعب بها من قبل كل micropipette حملة الميكانيكية التي شنت على المجهر وناعما وضعه مع micromanipulator ثلاثة محاور هيدروليكية. ويمكن استخدام المتلاعبين الميكانيكية من نيوبورت كذلك. هي التي شنت واحدة من أصحاب micropipette على المترجم كهرضغطية ، يتم التحكم فيها من قبل سائق رمز LABVIEW الكمبيوتر (متوفر عند الطلب) ، ويترجم من خلال لوحة إشارة دق عبر مكبر للصوت الجهد (محلية الصنع) على المحرك بيزو. هذا الأمرllows واحد لنقل بدقة وماصة repeatably في التصاق دورة الاختبار. يستخدم النظام الفرعي للتحكم في تنظيم ضغط الشفط أثناء التجربة. يربط خط الهيدروليكية صاحب micropipette إلى خزان السائل. A ميضعة غرامة الميكانيكية يسمح ارتفاع الخزان التلاعب بدقة.
يتم إنشاؤها باستخدام Micropipettes KIMAX ذوبان أنابيب زجاجية نقطة البورسليكات الشعرية (مع خارج القطر من 1.0 ± 0.07 ملم وقطرها من الداخل 0.7 ± 0.07 ملم. أولا ، يتم سحبها من الأنابيب الشعرية micropipettes به PN - 30 Narishige 'بولير Microelectrode الزجاج الأفقي المغناطيسي (سوتر آلات Micropipette بولير هو خيار آخر مجتذب) ، ويستخدم نظام Microforge الثانية ، (بنيت في المنزل) لقطع micropipettes لافتتاح الحجم المطلوب. النماذج التجارية لنظم Microforge تتوفر كذلك.
لتجنب اهتزاز micropipettes خلال التجربة ، وmicroscمكتب مستشار رئيس الوزراء ، جنبا إلى جنب مع micromanipulators ، يتم وضعها على جدول تعليق هوائي.
الشكل 3 تشغيل التصاق F تردد عن ط محددة (A) وغير محدد (B) في ملزمة 1S (الحمراء) ، و10S مرات الاتصال (الأزرق) يقاس من تكرار دورات اختبار الالتصاق بين كرات الدم الحمراء المغلفة مع ICAM - 1 (أ) أو hIgG (B ) مع العدلات الإنسان معربا عن إنتغرين β α L 2. ط = F (X X 1 + 2 +... + X ط) / ط (1 ≤ ≤ ط ن) ، حيث i هو فهرس دورة الاختبار ، X ط يساوي "1" وقد استخدم (الالتصاق) أو "0" (أي التصاق). F ن (ن = 50) ، وأفضل تقدير لاحتمال الالتصاق.
الشكل 4 حركيةICAM - 1 ملزمة لإنتغرين العدلة β α L 2 ( 
). احتمال التصاق قياس كما هو موضح في الشكل رقم 3 لأزواج الخلايا الثلاث في كل مرة يتم الاتصال المتوسط ورسم مقابل وقت الاتصال. كانت غرفة متوسطة HBSS 1MM مع كل من الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + زائد 1μg/ml من مثنوي - E - selectin الإيج لupregulate α β L 2 ملزمة. لالتقاط ICAM - 1 - الإيج على كرات الدم الحمراء ، وأضيف خطوة وسيطة لاحتضان كرات الدم الحمراء مع الضد التقاط 10μg/ml (biotinylated الماعز المضادة للجسم البشري التيسير ، eBioscience) بعد الخطوة streptavidin الحضانة. للسيطرة على شرطين غير محدد ملزم مختلفة استخدمت : 1) كرات الدم الحمراء المغلفة مع الأجسام المضادة الطبيعية المضادة للبشرية التيسير وحضنت مع مفتش الإنسان بدلا من ICAM - 1 - الإيج (O) و 2) العدلات ملزمة لكرات الدم الحمراء غير المغلفة مع القبض على الضد (Δ). واضاف مفتش 10μg/ml الإنسان إلى وسيلة للحد من ربط البريدselectin - - الإيج في حل لالتقاط الأجسام المضادة على سطح خلايا الدم الحمراء. وقد استخدم ملزم غير محدد كما هو مسجل الإنسان منحنى مراقبة مفتش الحكومة للحصول على احتمال التصاق محددة منحنى ( 
) باستخدام المعادلة. 2. تركيب احتمال التصاق محددة مع منحنى المعادلة. عاد 1 (خط الصلبة) تقارب فعالة وملزمة ك ج أ = 1.4 • 10 μm4 -4 وقبالة ك = 0.3 ق -1.
| الكاشف | ميغاواط (ز / مول) | تركيز (ملم) | المبلغ (ز) |
|---|---|---|---|
| الأدينين | 135.13 | 2 | 0.27 |
| مد الجلوكوز (سكر العنب) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D - المانيتول | 182.17 | 55 | 10.02 |
| كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة (نا هبو ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L - الجلوتامين | 146.15 | 10 | 1.46 |
الجدول 1. التحضير EAS - 45 العازلة (1L).
| 25 ملغ البيوتين XHS في 550 ميكرولتر من DMF | 0.1M البيوتين الحل |
| 01:10 التخفيف من البيوتين ث 0.1 / DMF | 0.01M البيوتين الحل |
| 1:100 التخفيف من البيوتين ث 0.1 / DMF | 0.001M البيوتين الحل |
الجدول 2. إعداد الحل البيوتين.
| البيوتين التركيز النهائي (ميكرومتر) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| كرات الدم الحمراء الأسهم بيليه (ميكرولتر) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1X PBS (ميكرولتر) | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1M بورات العازلة (ميكرولتر) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M البيوتين الحل (ميكرولتر) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001M البيوتين الحل (ميكرولتر) | 0.8 | 2 | 4 |
الجدول 3. Biotinylation من كرات الدم الحمراء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لاستخدام بنجاح وتيرة التصاق مقايسة micropipette ينبغي للمرء أن ينظر في اتخاذ خطوات حاسمة عدة. أولا ، تأكد من أن يسجل التفاعل محددة لنظام مستقبلات يجند من الفائدة. قياسات التحكم غير محدد (راجع الشكل رقم 3 ، 4) ضمان النوعية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون احتمالات التصاق غير محدد أدناه 0.05 لجميع فترات وقت الاتصال والحصول على فارق كبير بين احتمالات التصاق محددة وغير محددة عن كل نقطة زمنية. ويمكن استخدام أساليب مختلفة ليغاندس الزوجين على سطح كرات الدم الحمراء. فقد تبين أن طريقة كلوريد الكروم اقتران 17 أعطى أعلى مستوى ملزم غير محدد من البيوتين streptavidin اقتران.
ثانيا ، يجب على احتمال انضمام للتفاعل معينة تكون في المدى المتوسط. ويمكن استيفاء هذا الشرط من خلال تغيير كثافة المستقبلات ويغاندس (أو يغاندس فقط على كرات الدم الحمراء إذا أعرب constitutively المستقبلات على الخلاياق كثافة يصعب تغيير). لهذا الغرض ، عند اختبار نظام جديد مع تقارب مستقبلات يجند مجهولة الملزمة ، وإعداد مجموعة من كرات الدم الحمراء biotinylated (انظر الجدول الثالث كمثال) لاختبار مجموعة متنوعة من الكثافة يجند. وينبغي أن احتمال التصاق المطرد للدولة أن يكون هناك أكثر من 0.8 في المتوسط نحو الخلية الى خلية تباين كثافة مستقبلات يجلب عادة من مستوى التصاق بعض الخلايا إلى 1 إذا كان متوسط كثافة يجند مرتفع جدا. خلال الاختبارات الأولية للخصوصية ، إذا كان لديهم مستويات بعض الخلايا من الالتصاق 0 أو 1 ، وكثافة يجند بحاجة إلى تعديل. قياسات التحكم غير محدد وعادة ما تتبع قياسات محددة ، وهنا واحد يود أن يكون احتمال التصاق أقرب إلى الصفر قدر الإمكان.
الثالثة ، والعثور على النطاق الصحيح لأوقات الاتصال. إذا كان الوقت ما يكفي الاتصال لفترة طويلة إكسب (-- ك قبالة ر) المصطلح في المعادلة. 1 يذهب إلى الصفر ، ويمكن حساب التقارب الفعال 2D من مستوى الهضبةالمنحنى التصاق 1 : 
ك للخارج يحدد معدل قبالة المرحلة الانتقالية أو مدى سرعة منحنى التصاق يصل إلى مستوى الهضبة. لتقدير معدل خارج يتطلب دقة قياسات عدة نقاط على مستوى الهضبة فضلا عن نقاط وقتا كافيا في المرحلة الانتقالية. والمحاسبة على الخطوات الحاسمة الثلاثة المذكورة أعلاه ملزمة للمرء الحصول منحنيات تشبه الشكل. 4.
المهمة المتبقية لاستخدام مستقبلات يجند نموذج حركية ملزمة لتفسير منحنى تقاس تجريبيا ملزمة وتقدير للمعلمات الحركية 2D من تركيب نموذج التنبؤ على البيانات. وتجدر الإشارة إلى أن المعادلة. 1 يمثل أبسط نموذج النظام الثانية إلى الأمام ، عكس الدرجة الأولى ، خطوة واحدة ، عكس حركية بين الأنواع مستقبلات يجند واحدة 1. وقد وصفت العمليات الحركية أكثر تعقيدا ، بما في ذلك ال(ه) من الحالات الأنواع مستقبلات يجند 3،4 المزدوج ، على مرحلتين ملزمة دون 14 أو 19 مع التفاعلات trimolecular ، وحركية محدودة بسبب التصاق تشكيل موقع نشط بدلا من السندات حركية 10. في هذه الحالات ، يطلب من النماذج الرياضية أكثر انخراطا في الربط بين احتمال التصاق مقابل الاتصال منحنى الزمن وحركية مستقبلات يجند ملزمة.
والاهتمام المستمر في حركية التفاعل مستقبلات يجند ينبع من الفرضية الأساسية التي المعلمات حركية تلعب دورا في تحديد الأحداث يشير الى المصب داخل الخلية. تردد التصاق micropipette مقايسة المقدمة هنا هي واحدة من عدد قليل جدا من الطرق التي تسمح في القياسات الموقعية للحركية (2D) ثنائي الأبعاد ملزمة. ثنائي الأبعاد يعني أن كلا من المستقبلات ويغاندس وعلى السطوح الخلية ، كما يحدث بشكل طبيعي في التفاعلات خلية خلية كثيرة داخل الحي. ومعدل 2D الثوابت الحركية للدوري الدرجة مستقبلاتوملزمة بتقديم معلومات عن كيفية ربط الخلايا بسرعة مع بعضها البعض أو إلى المصفوفة خارج الخلية ، وكيف أنها لا تزال ملزمة طويلة ، وكيف سيكون شكل العديد من السندات. بالمقارنة ، في أسلوب مأكل مثل الطحين السطحية (SPR) الرنين 23 واحدة من الجزيئات المتفاعلة في مرحلة السوائل ، وبالتالي دعا ثلاثية الأبعاد (3D) ملزمة. لأن كلا تنقية جزيئات التفاعل ومعزولة عن البيئة الخلوية ، يمكن أن المعلمات التي تم الحصول عليها في قياس الحركية 3D تكون مختلفة جذريا عن تلك التي حصلنا عليها في القياسات 2D حتى للزوج مستقبلات يجند نفسه 17.
أسلوب تحليل التردد التصاق حركية 2D على غشاء الخلية الحية ، ويوفر بالتالي فرصة لأحد لتحليل الأنظمة البيوفيزيقية والبيوكيميائية البيئة الخلوية. وتشمل هذه الغشاء microtopology 5 ، 2 مرساة الغشاء ، والتوجه الجزيئية وطول 6 و 9 و صلابة الناقل curvaتلح 20 ، قوة اعتداءات 20 ، وجهري من الهيكل الخلوي وتنظيم الغشاء حيث تتفاعل الجزيئات الموجودة 15،17.
لأن صلي عبر مستقبلات يجند التفاعل يتطلب الاتصال المادي المباشر بين خليتين والنتائج الفعلية في الربط بين خليتين ، يمكن تحليل حركية التفاعل الكيميائي الجزيئي للتفاعل من خلال الفحص الميكانيكي الذي يضع الخلايا في الاتصال وملزمة بالكشف عن تأثير القوة. وإن كنا مثالا للمقايسة تردد التصاق باستخدام micropipette RBC - يستنشق باعتبارها استشعار الالتصاق ، يمكن استخدام تقنيات القوة الأخرى ، بما في ذلك الفحص المجهري القوة الذرية 24 ، غشاء حيوي التحقيق 8،17 القوة البصرية ملاقط 25 ، وmicropipette متكاملة وناتئ 26.
وقد وضعت الأخرى المقايسات 2D ميكانيكيا مقرا لها. وتشمل هذه التقلبات الحرارية مقايسة 8 ، centrifugaمقايسة 27،28 نشوئها ، rosetting مقايسة 29 ، وتدفق مقايسة غرفة 30،31.
الحد من التصاق مقايسة التردد هو طبيعة بطيئة وكثيفة العمالة للفحص بسبب دورات المسلسل يتكرر مع زوج واحدة من الخلايا اختبار جهة اتصال واحدة في وقت واحد. يصبح من الصعب على مستقبلات يجند التفاعل مع معدلات خارج بطيئا بسبب سيلزم مرات الاتصال الطويل للمنحنى ملزم للوصول إلى حالة استقرار ، مما يجعل من تجربة طويلة inhibitively.
محول القوة التي شيدت من قبل RBC - micropipette يستنشق قادر piconewton للكشف عن مستوى القوات ، وهو أمر من حجم أقل من قوة نموذجية لسندات مستقبلات يجند noncovalent 1،32. ومع ذلك ، يمكن أن يجند مستقبلات تفارق يحدث حتى عند مستوى الصفر القوات. أي أن يذهب ضعيفة الالتصاق يؤدي كشفها إلى التقليل من تقارب ملزم وعلى اساس سعر 1.
Tانه طريقة التصاق تردد يفترض أن كل اختبار التصاق مطابق ومستقلة عن غيرها. قد يتم انتهاك هذا الشرط كما تبين لبعض أنظمة 33 ، حيث التصاق الحالية زيادة أو نقصان احتمال التصاق المقبل. ماتلاب رمز لفحص إذا اجتمع شرط لتسلسل الأحداث المسجلة التصاق متاحة عند الطلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01HL091020 ، R01HL093723 ، R01AI077343 وR01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
