Summary
두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.
Abstract
micropipette 부착 분석은 2 차원 (2D) 수용체 - 리간드 바인딩 속도론 1 측정하기 위해 1998 년에 개발되었습니다. 분석은 부착 센서와 상호 작용하는 분자 중 하나를 제시 세포로 인간의 적혈구 (RBC)를 사용합니다. 그것은 정확하게 제어 영역과 결합 형성을 활성화하기 위해 시간과 다른 상호 작용하는 분자를 표현 다른 세포와 접촉에 RBC를 가지고 미세 조작을 사용합니다. 접착 이벤트가 떨어져 두 세포를 당기시 RBC의 신장으로 감지됩니다. RBC 표면에 고정화 리간드의 밀도를 조절하여 접착의 확률은 0과 1 사이의 미드 레인지에 보관됩니다. 유착 확률은 주어진 접촉 시간이 두 세포 사이의 접촉 반복주기의 순서에 유착 사건의 주파수 추정된다. 연락처 시간을 변화하는 것은 바인딩 커브를 생성합니다. 바인딩 수용체 - 리간드 반응 속도론 1 확률적 모델 피팅곡선은 2D 친화력과 오프 속도를 반환합니다.
분석은 IgG FC 1-6 glycoconjugate 리간드 6-9, 리간드 10-13, homotypical cadherin 구속력이 14 펩타이드 - 주요 histocompatibility의 단지 15 T 세포 수용체와 coreceptor과 integrins와 selectins과 Fcγ 수용체의 상호 작용을 사용하여 검증되었습니다 - 19.
방법은, 같은 멤브레인 microtopology 5, 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9, 곡률 20과 충돌 힘 20,뿐만 아니라 생화 학적 요인 biophysical 요소에 의해 2D 속도론의 규정을 계량하는 데 사용되었습니다 상호 작용하는 분자가있는 cytoskeleton과 멤브레인 microenvironment하고 이러한 분자 15,17,19의 표면 조직의 모듈 레이터 등.
방법은 t에도 사용되고 있습니다O는 수정된 모델 21를 사용하여 이중 수용체 - 리간드 종 3,4의 동시 구속, 19 trimolecular 상호 작용을 공부합니다.
방법의 주요 장점은 자신의 기본 멤브레인 환경에서 수용체 연구를 허용한다는 것입니다. 결과는 정화 수용체 17를 사용하여 얻은 이들의 매우 다른 수 있습니다. 또한 잘 전형적인 생화학 방법을 넘어 시간적 해상도를 가진 하위 초 timescale에있는 수용체 - 리간드 상호 작용의 연구를 수 있습니다.
micropipette 부착 주파수 방법을 설명하기 위해, 우리는 α L의 β 2 활성화 솔루션에 dimeric E - selectin과 neutrophils에서 인테 그린 α L의 β 2 구속력 RBCs에 작용 세포 유착 분자 1 (ICAM - 1)의 속도론 측정을 보여줍니다.
Protocol
1. 전체 혈액에서 RBCs 절연
- EAS - 45 솔루션을 준비합니다. 테이블 내의 모든 재료를 무게 및 DI 워터 100 - 200ml에 용해. 1000ml 솔루션을 만들고 8.0 산도를 조정하기 위해 물을 추가합니다. 50ml에 의해 필터 나누어지는. 스토리지 -20 ° C에서 고정.
참고 : 단계 1.0 기관 검토위원회 승인을 프로토콜과 함께 간호사로 훈련 의료 전문가 등에 의해 수행되어야합니다.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함 10ml 튜브에 평균 cubital 정맥에서 혈액 3 - 5ml를 그려 부드럽게 즉시 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)으로 혈액을 혼합하고 철저하게 염증을 막을 수 있습니다.
- 공정 혈액 샘플 가능한 한 빨리. 원심 분리를 제외한 모든 다음 단계는 준비가 멸균 유지하는 후드를 완료해야합니다. , 50ml 원심 튜브에 혈액을 전송 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 추위와 무균 1077 Histopaque 및 원심 분리기의 10ml를 추가 두 번 반복합니다.
- 10 추가ML 추위와 멸균 PBS, 5 분 @ 1000rpm을위한 원심 분리기, 4 ° C. 뜨는을 제거합니다. 4 번 (5 번 총) 반복합니다.
- 두번 무균 EAS - 45 (5 분 @ 1000rpm, 4 ° C)로 씻으십시오. 새로운 멸균 15ml 튜브에 마지막으로 세척 이동 RBCs 동안.
- Resuspend RBCs in10ml EAS - 45.
2. RBCs에 biotinylation
- 1 단계에서 RBCs로 튜브를 가져가라. 5 분 @ 1000rpm 4 ° C.에 대한 centrifuging 후 모든 뜨는을 제거 여러 개의 튜브 각 RBCs 펠렛의 10μl를 넣고 (6 다양한 RBCs의 biotinylation의 농도의 준비 예를 들어 표 II 참조) 각 유리병에 PBS의 해당 금액을 추가합니다.
- 표 II에 따라 신선한 Biotin-X-NHS/DMF 1시 10분, 1:100 dilutions하십시오.
- 각 유리병에 0.1M borate 버퍼 10μl를 추가합니다.
- 즉시 계산 각 유리병에 비오틴 솔루션의 금액 (예를 들어 표 II 참조)하고 와동을 추가합니다.
- 각 RBC의 약병 장소50ml 원뿔 튜브 및 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어 내부.
- 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 800μl로 각 유리병 3 번씩 씻으십시오.
- 4 각 유리병 및 저장하는 EAS - 45의 100μl를 추가 ° C. 최종 솔루션의 각각 1μl에 지금 RBCs의 ~ 1mln해야합니다.
3. RBCs에 비오틴 - 연결된 리간드 *을 Functionalizing
- 제조 업체의 지침에 따라 2mg/ml streptavidin 용액을 준비합니다. Aliqouted 솔루션은 -20 ° C.에 저장될 수 있습니다
- 즉시 streptavidin 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 2.7 (10μl)에서 RBCs의 동일한 금액을 혼합하고 4 30 분에 대한 회전에 품어 ° C.
- 2min @ 2000rpm을위한 EAS - 45의 500μl 3 번 씻으십시오. 15μl EAS - 45 스토리지 / 1 % BSA를 추가합니다.
- 즉시 20μg/ml 리간드 솔루션, 소용돌이와 함께 스텝 3.3 (10μl)에서 RBCs의 같은 양을 혼합하여 실온에서 30 분에 대한 회전에 품어.
- 중 500μl로 두 번 씻으 EAS -2min @ 2000rpm에 대한 1분의 45 %의 BSA. 스토리지 EAS - 1분의 45 %의 BSA의 15μl를 추가합니다.
* 귀하의 단백질이 더 비오틴 링크가 없다면 당신은 단백질 biotinylation에 대한 상용 키트 중 하나를 (예를 들어, 써모 과학은 # 21955 EZ - 링크 마이크로 NHS - PEG4 - Biotinylation 키트)를 사용하거나 그림과 같이 중간 단계로 biotinylated 캡처 항체를 사용하여 동영상 인치
4. 수용체와 리간드 밀도의 부량
- 각 mAbs의 포화의 농도와 다른 유리병, 수용체 - 베어링 세포 상온에서 30 분 동안 3 단계의 리간드 - 코팅 RBCs를 품어합니다. 제어를위한없는 isotype 검색 항체와 함께 별도의 튜브 세포에 품어. 기본 항체가 찬란 표시되지 않는 경우에는 제조 업체의 지시에 따라 찬란 - 복합 차 항체와 함께 품어.
- 해당 형광 칼과 흐름 cytometery에 의해 단계 4.1 준비 샘플 분석ibration 비즈. 로 그림에 표시된 밀도를 계산합니다. 1.
5. micropipette과 셀 챔버 준비
- PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러 또는 셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러를 사용하여 모세관 튜브에서 micropipettes를 가져옵니다.
- 원하는 크기 (보통 1 - 5μm에서 필요한 직경 범위 연구에 사용되는 세포의 크기에 따라)에 뽑아 micropipette의 팁을 조정 microforge과 micromanipulator를 사용하십시오.
- 원하는 크기로 현미경 커버 유리를 절단하여 셀 챔버를 준비합니다. 실험 중에 osmolarity를 변경하는 중간 증발을 방지하기 위해 양쪽에서 미네랄 오일을 사용하여 챔버를 밀봉합니다.
- 실로 수용체와 리간드 - 베어링 세포를 추가합니다.
6. Micropipette 부착 주파수 분석
- 각 pipettes하여 상호 작용하는 세포를 기음과 컴퓨터 프로그램 piezoelectr를 사용하여 IC 번역은 제어 문의 공간 및 시간이 다른 세포와 접촉 밖의 RBC를 운전합니다. 세포 분리시 RBC의 연신율을 관찰하여 접착 이벤트를 감지.
- 주어진 접촉 시간에 대한 문의 - 철회주기에게 50-100 번 반복합니다. Excel 스프레드 시트의 열에서없이 접착을위한 접착 또는 "0"에 대한 "1"을 추가하여 관찰 부착 이벤트를 기록합니다. 당신은 미세한 이미지, 예를 들어, 디지털 미디어 또는 비디오 테이프를 녹화 장치를 사용할 수 있습니다.
- 부착 주파수 대 의미와 SEM을 얻기 위해 각 접촉 시간에 적어도 세 가지 다른 세포 쌍을 사용하여 문의 시간 곡선을 기록합니다.
- 그들의 구체적인 기능 봉쇄의 mAbs를 사용하여 리간드 또는 수용체를 차단없는 리간드 (예 : BSA) 및 / 또는 코팅 RBCs를 사용하여 컨트롤에 대한 특이 현상이 바인딩 커브를 기록합니다. 각 연락처 시점에서 특정 접착 주파수는 특이 현상이 부착 주파수 1 제거하여 계산하실 수 있습니다.
- 특정 부착 주파수를 맞추기 P 전달 두번째 순서와 첫 순서 수용체의 단일 수종과 리간드 1 단일 종 사이의 역방향 단일 단계 상호 작용을 설명하는 확률적 모델 (수식 1)에 의해 비교 문의 시간 t 데이터 :
K는 2D 효과적인 바인딩 친화력은 K가 오프 오프 요금은, M R 및 M 난 4 단계에서 측정한 각각의 수용체와 리간드 밀도뿐입니다이며, C는 접촉 영역입니다. 곡선 맞춤가 C와 K가 효과적인 2D 친화 함께 일괄와 총칭이라고 같이 두 개의 매개 변수, C K A와 K 임무를 가지고 있습니다. 오프 속도의 제품은 효과적인 2D에서 속도입니다 C K에 = C K X K 해제.
구체적인 접착력 주파수 P는 전체 측정 부착 (P 측정) 1,21에서 특이 현상이 부착 분율 (P 특이 현상)의 뺄셈으로 계산됩니다 :
8. 대표 결과 :
인테 그린 α L의 β neutrophils 2 사이트 밀도의 1 결정을 그림. Neutrophils 먼저 그림 3,4 또는 E - selectin - IG없이 사용하는 실험 조건을 일치하는 10 분에 대해 E - selectin - IG의 1μg/ml와 incubated 후 PE - 복합 백신의 포화의 농도 (10μg/ml)로되었습니다 인간 CD11a mAb (복제 HI111 특정 표를 참조시약 및 장비) 또는 컨트롤에없는 마우스 IgG1은 씻어하고, 즉시 분석했다. 샘플은 표준 QuantiBRITE PE 교정 비즈와 BD LSR 흐름 cytometer에 읽어되었습니다. 패널 A는 E - selectin - IG 처리 (파란색) 또는 치료 세포 (녹색)의 사람과 함께 교정 비즈의 형광 histograms (분홍색)을 보여줍니다. 특정 CD11a mAb의 얼룩은 고체 곡선과 관련이없는 isotype 검색 컨트롤 항체 얼룩이 곳곳에 곡선에 표시됩니다에 표시됩니다. 치료 세포와 비교에서 본대로 E - selectin - IG (모든 세탁 단계와 FACS 버퍼에 존재) 대우 세포는 CD11a 밀도에 영향을주지 않았다. 패널 B는 밀도 부량 과정을 보여줍니다. Log10는 패널에서 네 개의 교정 비드 histograms의 각 피크 값의 평균 형광 강도 (FI)에 대한 계산 (핑크 원)와 구슬 당 많은 특정 PE 분자에 대한 (제조 업체). Log10 fluoresc에 대한 비드 당 Log10 PE 분자의 선형 회귀줬어도 꾸몄다되었습니다. E - selectin 취급 전지 respectivly 3.99 (파란색 고체 동그라미)와 특이적인 mAb 및 제어 항체에 대해 2.23 (파란색 오픈 동그라미), 동등한 Log10 FI (Y) 값. 우리는 X (값이 패널 B에 녹색과 파란색 동그라미로 꾸몄다 있습니다)에 대한 선형 방정식을 해결 X = Log10 PE PE로 / 세포와, :., neutrophils에서 α L의 β 2의 총 숫자는 mAb 비율이 1시 1분 있었다 9587으로 계산. 표면 밀도는 호중구 직경 22로 8.4μm를 사용하여, 43 분자 / μm의 두 것으로 계산되었다. ICAM - 1의 밀도는 마찬가지로 65 몰 / μm의 2 말았네 PE - 안티 인간 CD54 mAb를 사용하여 플로우 cytometery에 의해 측정되었다.
그림 2 Micropipette 시스템 설계도. 우리 micropipette 시스템은 집에서 조립 세 서브 시스템으로 구성되어 있습니다되었습니다 이미징 서브 시스템을 하나, 레크 리에이션을 관찰할 수 있도록오드 및 분석 micropipette - aspirated 세포의 움직임, 하나 셀 챔버에서 세포를 선택할 수 있도록 미세 조작 서브 시스템 및 압력 서브 시스템은 하나 micropipettes로 세포를 대기음 수 있습니다. 이미징 서브 시스템의 중앙 조각은 100x 기름 침지 1.25 NA의 목적으로 (올림푸스 IMT - 2 IMT2) 현미경을 반전합니다. 이미지는 무료 커플 장치 (CCD) 카메라를 통해 비디오 카세트 레코더로 전송됩니다. 비디오 타이머는 시간을 추적할 수있는 시스템으로 결합됩니다. 각 micropipette은 현미경에 장착된 가늘게 3 축 유압 micromanipulator와 위치 기계적 드라이브로 조작하실 수 있습니다. 뉴 포트에서 기계 manipulators 역시 사용될 수 있습니다. micropipette 홀더 중 하나가 압전 변환기에 탑재의 드라이버는 압전 액추에이터에 전압 앰프 (수제)를 통해 컴퓨터를 LabView 코드 (요청시 사용 가능)와 DAQ 보드를 통해 신호 변환에 의해 제어됩니다. 이llows 한 접착 테스트 사이클에서 정확하고 repeatably 피펫 이동합니다. 압력 조절 시스템은 실험 기간 동안 흡입을 제어하는 데 사용됩니다. 유압 라인은 액체 저수지에 micropipette 홀더를 연결합니다. 좋은 기계 포지셔너는 저수지의 높이를 정확하게 조작 수 있습니다.
Micropipettes는 KIMAX의 융점 borosilicate 유리 모세관 튜브 (1.0 이외의 직경 ± 0.07 mm와 0.7의 내부 직경 ± 0.07 mm를 사용하여 생성됩니다. 첫째, 모세관 튜브의 micropipettes가 PN - 30 Narishige '자기 유리 Microelectrode 수평 풀러를 사용 행진 (셔터 인 스트 루먼트 Micropipette 풀러 다른 풀러 옵션입니다.) 둘째, Microforge 시스템 (집에서 만든) 원하는 크기 오프닝에 micropipettes를 잘라하는 데 사용됩니다. Microforge 시스템의 상용 모델뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.
실험 microsc 동안 micropipettes의 진동을 방지하려면ope, micromanipulators와 함께 에어 서스펜션 테이블에 배치됩니다.
그림 3을 위해서 접착 주파수 F를 실행하는 특정 (A) 및 특이 현상 (B) 1s (빨간색)에 구속하고 10 초 ICAM - 1 (A) 또는 hIgG와 코팅 RBCs 사이에 반복적으로 접착 테스트주기에서 측정 (파란색) 접촉 시간 (B ) 인테 그린 α L의 β 2를 표현하는 인간 neutrophils과 함께. F I = (X 1 + X 2 + ... + X 제가) / 전 (1 제가 테스트주기 색인 ≤ I ≤ N), X 난 "1"동일 (접착) 또는 "0"(노 부착). F N (N = 50)가 부착 확률위한 최상의 견적로 사용되었다.
4 속도론 그림호중구 인테 그린 α L의 β 2 ICAM - 1 바인딩 ( 
). 측정된 접착 확률은 각 연락처 시간 세 세포 쌍을 그림 3에 나와 평균입니다 문의 시간 대 꾸몄다. 챔버 매체 α의 L의 β에게이 바인딩을 upregulate하는 1mM 칼슘 2 각 + 및 MG 2 dimeric의 + 플러스 1μg/ml E - selectin - IG와 HBSS했다. , RBCs에서 ICAM - 1 - IG를 캡처하기 위해 중간 단계는 streptavidin 보육 단계 후 10μg/ml 캡처 항체 (biotinylated 염소 - 안티 인간 FC 항체, eBioscience)와 RBCs를 부화 추가되었습니다. 특이 현상이 구속력이 두 가지 조건을 제어하는 데 사용되었다 : 1)는 RBCs로 코팅된 아닌 반 인간 FC 캡처 항체로 코팅하고 그 대신 RBCs에 바인딩 ICAM - 1 - IG (O)과 2) neutrophils 인간의 IgG와 incubated (Δ) 항체를 캡처합니다. 10μg/ml 인간 IgG는 E의 바인딩 최소화하는 매체에 추가되었습니다RBC 표면에 캡처 항체에 용액에 - selectin - IG. 인간 IgG 제어 곡선로 기록 특이 현상이 바인딩은 특정 부착 확률 곡선을 (얻기 위해 사용되었다 
) EQ를 사용하여. 2. EQ와 피팅 특정 부착 확률 곡선. 1 (실선)은 효과적인 구속력 친화력 C K = 1.4 • 10 -4 μm4와 K 해제 = 0.3의 -1를 반환했습니다.
| 시약 | MW (g / 몰) | 농도 (㎜) | 금액 (G) |
|---|---|---|---|
| 아데닌 | 135.13 | 이 | 0.27 |
| D - 포도당 (덱스 트로 오스) | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D - Mannitol | 182.17 | 55 | 10.02 |
| 나트륨 염화물 (NaCl) | 58.44 | 50 | 2.92 |
| 인산 나트륨, 이염 (나 HPO ) | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L - 글루타민 | 146.15 | 10 | 1.46 |
표 1. EAS - 45 버퍼 준비 (1L).
| DMF의 550 μl 25 MG 비오틴 - XHS | 0.1M 비오틴 솔루션 |
| 0.1 비오틴 W / DMF의 1시 10분 희석 | 0.01M 비오틴 솔루션 |
| 0.1 비오틴 W / DMF의 1:100 희석 | 0.001M 비오틴 솔루션 |
표 2. 비오틴 솔루션의 준비.
| 비오틴 최종 농도 (μm의) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBCs 펠렛 주식 (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1X PBS (μl) | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1M borate 버퍼 (μl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M 비오틴 솔루션 (μl) | 일 | 이 | 3.2 | |||
| 0.001M 비오틴 솔루션 (μl) | 0.8 | 이 | 4 |
표 3. RBCs의 Biotinylation.
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Discussion
성공적으로 한 몇 가지 중요한 단계를 고려해야합니다 micropipette 부착 주파수 분석을 사용합니다. 첫째, 관심의 수용체 - 리간드 시스템의 구체적인 상호 작용을 기록해야합니다. 특이 현상이 제어 측정 (그림 참조하라. 3, 4)는 특이성을 보장합니다. 이상적으로, 특이 현상이 부착 확률은 접촉 시간에 대한 기간이 0.05 이하이어야하며 각 시점에 대한 구체적이고 특이 현상이 부착 확률 사이의 상당한 차이를 가지고 있습니다. 다른 방법은 몇 RBCs의 표면에 리간드를 사용할 수 있습니다. 그것은 방법 17 커플링 크롬 염화은 비오틴 - streptavidin 커플링보다 특이 현상이 바인딩의 높은 수준을 준 것으로 나타났습되었다.
둘째, 특정 상호 작용에 대한 부착 확률이 중간 범위에 있어야합니다. 이 요구 사항은 수용체가 constitutively 세포에 표현하는 경우 수용체와 리간드 (또는 RBCs에서만 리간드의 밀도 변화에 의해 충족 수 있습니다) 변경하기 힘들있는 밀도의. 이러한 목적으로, 미지의 수용체 - 리간드 결합 친화력으로 새 시스템을 테스트를 할 때, 리간드 밀도 다양한 테스트 biotinylated RBCs의 범위를 (예를 들어 표 III 참조) 준비합니다. 정상 상태 유착 확률이 더 이상으로 평균 0.8 이상이어야 휴대 전화의 평균 리간드 밀도가 너무 높은 경우 수용체 밀도 변화는 보통 1 일부 세포의 접착 수준을 제공합니다. 특이성에 대한 초기 테스트를하는 동안, 일부 전지는 0 또는 1의 부착 수준이있다면, 리간드 밀도는 조정되어야합니다. 특이 현상이 제어 측정은 일반적으로 특정 측정에 따라 여기에 하나는 가능한 한 제로에 가까운 확률로 접착을하고 싶습니다.
셋째, 접촉 시간에 대한 올바른 범위를 찾습니다. EQ의 용어 - (K에서 T) 문의 시간은 충분히 EXP 경우. 1 제로로 이동하고 효과적인 2D 친화력은 고원 수준에서 계산할 수부착 곡선 1 : 
오프 속도 K는 해제 인계 또는 얼마나 빨리 접착력 곡선이 고원 수준에 도달를 결정합니다. 오프 속도를 계산하기 위해서는 정확하게 전이 단계에서 고원 수준뿐만 아니라 충분한 시간 지점에서 여러 지점의 측정이 필요합니다. 한 위에서 설명한 세 가지 중요한 단계에 대한 회계는 그림과 비슷한 바인딩 곡선을 얻을 것이다. 4.
나머지 작업은 실험적으로 측정된 바인딩 곡선을 해석하고 데이터 모델 예측을 피팅에서 2D 운동 매개 변수의 추정 수용체 - 리간드 바인딩 속도론 모델을 사용하는 것입니다. 그것은 그 EQ 주목하여야한다. 1 앞으로 두 번째 순서의 간단한 모델을 대표하는, 단일 수용체 - 리간드 종 1 ~ 첫 주문 리버스, 단일 단계, 가역 속도론. 더 복잡한 운동 프로세스는 일을 포함하여 설명되었습니다이중 수용체 - 리간드 종 3,4, 19 trimolecular 상호 작용, 대신 채권 속도론 10 활성 사이트의 형성에 의해 제한 부착 속도론과 함께 2 단계 14없이 바인딩 또는 E 케이스. 이러한 경우에는 더 많은 참여 수학적 모델은 부착 확률 문의 대 시간 곡선과 수용체 - 리간드 바인딩 속도론을 연관 필요합니다.
수용체 - 리간드 상호 작용의 반응 속도론에 지속적인 관심 속도론 매개 변수는 세포 내부의 다운 스트림 신호 이벤트를 결정하는 역할을하는 근본적인 가설에서 유래. 여기에 제시 micropipette 부착 주파수 분석은 2 차원 (2D) 바인딩 운동의 현장 측정에서 허용 매우 몇 가지 방법 중 하나입니다. 두 수용체와 리간드가 세포 표면에있는 것으로 2 차원의 의미로 자연스럽게 유기체 내부의 여러 세포 세포 상호 작용에서 발생합니다. 수용체 - lig의 2D 운동 속도 상수그리고 바인딩 세포가 서로에게 또는 세포외 기질에 바인딩하는 방법에 대한 정보를 신속하게 제공, 그들은 구속 유지, 그리고 얼마나 오랫동안 얼마나 많은 채권 형태 것입니다. 비교함으로써, 표면 Plasmon 공명 (SPR) 메소드에서 상호 작용하는 분자의 23 하나는 액체 단계에 따라서 (3D) 입체 바인딩이라고합니다. 두 상호 작용하는 분자가 정화 및 세포 환경에서 격리되기 때문에, 3 차원 측정에서 얻어진 운동 매개 변수에도 같은 수용체 - 리간드 쌍 17 2D 측정에서 얻은 사람에서 크게 다를 수 있습니다.
유착 주파수 방법은 세포막을 생활에 2D 속도론을 분석하고 따라서 한 세포 환경의 biophysical 및 생화 학적 규정을 분석할 수있는 기회를 제공합니다. 이들은 멤브레인 microtopology 5 멤브레인 앵커 2, 분자 오리 엔테이션 및 길이 6, 캐리어 강성 9 curva 포함진짜야 20 충돌 힘 20, 및 상호 작용하는 분자가 15,17 거주 cytoskeleton과 멤브레인 조직의 모듈 레이터.
교차 junctional 수용체 - 리간드 상호 작용 두 셀을 두 세포 사이의 물리적 결합의 결과 사이에 직접 물리적 접촉을 필요로하기 때문에 분자 상호 작용의 화학 반응 속도론은 접촉 세포를두고 있으며 효과에 의해 바인딩을 감지하는 기계 분석하여 분석할 수 무력. 우리가 부착 센서로 micropipette - aspirated RBC를 사용하여 부착 주파수 분석을 exemplified 있지만, 다른 힘 기술은 원자 힘 현미경 24, biomembrane 힘 프로브 8,17, 광학 핀셋 25과 통합 micropipette 및 캔틸레버 26를 포함하여, 사용할 수 있습니다.
기타 기계 기반 2D assays가 개발되었습니다. 이들은 열 변동 분석 8 원심을 포함검정 29, 및 흐름 챔버 분석 30,31을 rosetting 기 분석 27,28.
부착 주파수 분석의 한계는 반복 시리얼 세포의 단일 쌍을 함께 사이클을 한 번에 하나씩 연락처를 테스트로 인해 분석의 느리고 노동 집약적인 성격이다. 긴 접촉 시간이 긴 실험 inhibitively 만들기, 정상 상태에 도달 바인딩 곡선에 필요한 것입니다 때문에 속도가 느린 오프 속도 수용체 - 리간드 상호 작용에 대한 어렵게됩니다.
micropipette - aspirated RBC에 의해 만들어진 힘 변환기는 noncovalent 수용체 - 리간드 결합 1,32의 전형적인 강도보다 낮은 정도의 순서입니다 piconewton 수준의 병력을, 검출이 가능합니다. 그러나, 수용체 - 리간드 해리는 제로 강제로라도 발생할 수 있습니다. 바인딩 친화력 및 속도 1 싼 견적에 들키지 않고 리드를가는 모든 약한 접착.
티그는 유착 주파수 방식은 각각의 접착력 시험가 동일하고 다른 독립 있다고 가정합니다. 현재 접착력이 증가 또는 다음 부착의 가능성을 감소 일부 시스템 33에 표시되면서이 요구 사항을 위반한 수 있습니다. 요구가 유착 사건의 기록 순서에 대한 충족하는 경우 확인을위한 Matlab 코드는 요청시 가능합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금 R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 및 R01GM096187 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
