Summary
粘附频率检测，用于测量当两个分子相互作用的细胞表面锚定受体 - 配体相互作用的动力学描述。使用一个微管加压作为粘附传感器的人体红血细胞和整合αLβ2和细胞间粘附分子-1受体和配体相互作用，这种机械为基础的检测例证。
Abstract
微管黏附实验是在1998年开发的，衡量的二维（2D）受体-配体结合动力学。检测使用传感器粘附细胞相互作用的分子之一，并提出一个人的红细胞（RBC）的。它采用显微操作与另一个细胞的表达与精确控制的区域和时间，使债券形成的其他相互作用的分子接触，使红细胞。红细胞伸长后发现，除了拉动两个细胞黏附事件。通过控制固定的红细胞表面上的配体的密度，粘连的概率保持在0和1之间的中档。粘连的概率估计在两个细胞之间的一个给定的接触时间的反复接触，周期序列的粘附事件的频率。不同的接触时间，产生一个具有约束力的曲线。拟合概率模型的结合受体-配体反应动力学1曲线返回2D的亲和力和关闭率。
该试剂盒已通过验证，使用与IgG的Fc 段 1-6，选择素与糖缀合物的配体6-9，与配体10-13 homotypical cadherin 的约束力14，T细胞受体与辅助受体肽主要组织相容性复合物15整合Fcγ 受体的相互作用- 19。
该方法已用于生物物理因素，如膜microtopology 5，膜锚2，分子取向和长度为6，承运人刚度9，曲率20，和撞击力20，以及生化因素，量化的二维动力学的规定，如调制的骨架和膜的微环境相互作用的分子， 这些分子表面，15,17,19组织。
该方法也被用来吨Ø研究并发约束力的双种受体-配体3,4，和19三分子相互作用使用修改后的模型 21 。
该方法的主要优点是，它允许在他们的母语膜环境受体的研究。结果可能会非常不同，从获得使用纯化的受体 17 。它还允许在时间分辨率，远远超出了典型的生化方法分一秒的时间尺度的受体 - 配体相互作用的研究。
要说明的微量粘附频率的方法，我们动力学测量间粘附分子-1（ICAM - 1）红细胞约束力的解决方案中的E -选择与二聚体的中性粒细胞激活α大号β2整合素α大号β2功能。
Protocol
1。从全血红细胞隔离
- 准备EAS - 45解决方案。重达从表一的所有成分，并溶于DI水100 200毫升。加水使千毫升解决方案，并调整pH值至8.0。过滤和分装50毫升。冻结储存在-20 ° C。
注：作为一名护士，应当由受过训练的医疗专业等步骤1.2机构审查委员会批准的协议，。
- 绘制成10毫升含有EDTA管中位数肘静脉3血5毫升，轻轻混匀血用EDTA，立即彻底避免凝血。
- 尽快处理血液样本。离心除以下步骤应该做的引擎盖下，以保持无菌的准备。转移至50ml离心管中的血液，添加5分钟@ 1000RPM，4 ° C的寒冷和无菌Histopaque 1077和离心机10毫升重复两次。
- 新增10毫升冷，无菌PBS，离心5分钟@ 1000RPM，4 ° C。去除上清。重复4次（共5次）。
- 洗净用无菌EAS - 45（5分钟@ 1000RPM，4℃）的两倍。在过去的洗涤红细胞移动到一个新的无菌15毫升管。
- 悬浮红细胞in10ml EAS - 45。
2。红细胞生物素
- 以与步骤1中红细胞管。取出后5分钟@ 1000RPM，4 ° C离心上清红细胞沉淀中加入10μl到每个几个小瓶，并添加相应数额的PBS，每小瓶（例如准备六种不同的红细胞生物素浓度表二） 。
- 根据表二 ，做出新的Biotin-X-NHS/DMF 1:10，1:100稀释。
- 添加0.1M硼酸缓冲液中加入10μl每一瓶。
- 添加生物素的解决方案，以每一瓶（见如表二 ）的计算量和涡立即。
- 将每个红细胞小瓶一个50ml的锥形管和肩在室温下孵育30分钟内。
- 每一瓶洗净800μl的EAS - 45为2分钟@ 2000RPM的3倍。
- EAS - 45100μL每一瓶和储存于4 ° C。现在应该在每一个最终的解决方案的加入1μl〜1mln的红细胞。
3。 Functionalizing红细胞的生物素联配体*
- 根据制造商的指示，准备2mg/ml链亲和素溶液。 Aliqouted解决方案可能会储存在-20 ° C
- 从步骤2.7（10μL）混合等量的红细胞与链霉亲和素溶液，旋涡立即孵育30min后上肩在4 ° C。
- 2分钟@ 2000RPM的EAS - 45500μL洗3次。加入15μlEAS - 45 / 1％BSA的存储。
- 20μg/ml配体解决方案，涡（10μL）从步骤3.3混合等量的红细胞和肩在室温下孵育30分钟。
- 洗两次，500μLEAS -45 / 1％BSA为2分钟@ 2000RPM。 EAS - 45 / 1％的存储BSA的加入15μl。
*如果你的蛋白没有生物素的链接，您可以使用市售蛋白质生物素包（例如，Thermo Scientific的＃21955 EZ - Link的微型NHS - PEG4 -生物素包），或使用生物素捕获抗体作为一个中间步骤，如下所示在视频中。
4。受体与配体密度的定量
- 从第3步孵育配体涂层的红细胞，在不同的小瓶，受体含饱和浓度与各自的单克隆抗体的细胞在室温下30分钟。在单独的小瓶无关匹配的同型对照抗体细胞孵育。如果没有荧光标记的抗体，荧光标记的二抗孵育，根据制造商的指示。
- 分析步骤4.1准备流式细胞术样品与相应的荧光CALibration珠。计算图所示的密度。 1。
5。为微管的制备和细胞室
- 拉使用PN - 30 Narishige“磁性玻璃微电极水平拖轮或萨特仪器微管拖轮毛细管微量。
- 使用与microforge显微拉微量调整到所需的大小（通常所需的直径范围从1 -5μm的，要在研究中使用的细胞的大小而定）的提示。
- 准备削减到所需的大小显微镜盖玻片的细胞室。密封腔，从双方使用矿物油，以避免介质的蒸发，在实验过程中改变渗透压。
- 新增的受体和配体细胞会议厅。
6。微管粘附频率检测
- 各自移液器吸相互作用的细胞，并用计算机编程piezoelectr IC翻译驱动与控制的接触面积和时间与其他细胞接触和红细胞。检测细胞分离后，通过观察红细胞伸长的粘附事件。
- 对于一个给定的接触时间，重复接触回缩周期50-100倍。在Excel电子表格的列无粘连粘连或“0”，加入“1”，记录所观察到的粘附性事件。您可以使用录音设备，如数字媒体或录像带，显微图像。
- 记录每个接触的时间至少有三个不同的细胞对获得的均值和SEM的附着力频率与接触时间曲线。
- 使用无关配体（如BSA），和/阻止使用其特定的功能封锁单克隆抗体的配体或受体或涂红细胞记录控制的非特异性的结合曲线。在每个接触时间点的特异性粘附频率可以计算出清除非特异性粘附频率 1 。
- 适合具体的附着力频率 P A与接触时间T的数据概率模型（公式1），介绍了二阶和一阶扭转，单步之间相互作用的受体和配体 1，品种单一品种单一：
其中 K 2D有效的结合亲和力，K关闭的关闭率，M r 和 M，L，分别是受体与配体密度在第4步测， 和 C的接触面积。曲线拟合有两个参数， 一个 C K 一 K 关闭 ， 作为 C 和 K 一个混为一谈，并呼吁有效2D的亲和力集体。其关闭率的产品是有效的2D率： > C 钾 = A C K 一个X k。
特异性粘附频率P的计算方法是从总的测量粘附性（P）1,21（非特异性）的非特异性粘附分数加减：
8。代表性的成果：
图1整合α 大号β2中性粒细胞的站点密度的测定。中性粒细胞E -选择素，免疫球蛋白为10分钟1μg/ml培养相匹配的实验条件下，在数字3,4或没有E -选择素，免疫球蛋白，然后用饱和浓度PE标记的抗（10μg/ml）人类CD11a单克隆抗体（克隆HI111， 具体表试剂和设备）或无关控制鼠IgG1，洗净，并立即进行分析。样品读取BD LSR与标准的QuantiBRITE PE校准珠的流式细胞仪。 A组荧光直方图显示校准珠（粉红色）与E -选择素免疫球蛋白治疗（蓝色）或未经处理的细胞（绿色）。具体CD11a单克隆抗体染色所示的实线和虚线所示无关亚型对照抗体染色。与E -选择素- IG（所有洗涤步骤，在流式细胞仪缓冲）处理的细胞没有影响CD11a密度，与未经处理的细胞相比。 B组显示密度定量的过程。 LOG10计算的平均荧光强度（FI）的每四个校准珠小组直方图峰值（粉红色圆圈）和（制造商）为每珠的很多特定的PE分子。一个线性回归LOG10 PE分子每珠对LOG10 fluorescENCE绘制。 E -选择素处理的细胞的LOG10 FI（Y）值等于3.99（蓝色实心圆）和2.23（蓝色空心圆），为特定的人与生物圈计划和控制抗体，respectivly。我们解决了X（值B组的绿色和蓝色圆圈绘制）的线性方程X = LOG10 PE /细胞，如PE：单克隆抗体的比例为1:1，α大号β2中性粒细胞总数计算为9587。面密度计算为43个分子/ 微米 2，中性粒细胞直径 228.4μm 。 ICAM - 1的密度同样测流cytometery使用PE抗人CD54的单克隆抗体，这相当于65摩尔/微米2。
图2 微管系统原理图 。我们的微管系统是在内部装配和三个子系统组成：影像子系统，让一个观察，建议条例和分析微量吸气细胞的运动;一个显微子系统，使一个选择的细胞从细胞室，压力子系统，让吸进微量的细胞。成像子系统的核心部分是一个100X的油浸1.25 NA目标倒置显微镜（奥林巴斯IMT - 2 IMT2）。通过电荷耦合器件（CCD）摄像机，图像传送到录像机。视频定时器耦合系统的跟踪时间。每个微管可以由机械驱动器安装在显微镜和精细定位与三轴液压显微操纵。以及可用于从新港机械造。微量持有人之一，是安装在压电翻译，其中的驱动程序是通过电压放大器（自制），压电执行器控制计算机LabVIEW代码（根据要求提供），并通过数据采集板的信号转换。这是一个llows之一附着力测试周期的移动吸管，精确和可重复。压力调节子系统是用来控制在实验过程中的吸力。液压线连接到储液罐的微量持有人。一个优良的机械定位，使水库的高度精确的操纵。
微量移液器使用KIMAX熔点高硼硅玻璃（外径1.0 ± 0.07毫米，内径0.7 ± 0.07毫米毛细管生成首先，从毛细管微量使用PN - 30 Narishige“磁性玻璃微电极技术水平拖轮拉（萨特仪器微管拖轮是另一个拉马选项）。二，Microforge系统（造房子）是用来切割到所需的大小开幕微量。Microforge系统的商业模式以及。
为了避免在实验过程中，显微的振动的微量OPE，以及与micromanipulators，被放置在一个空气悬架表。
图3运行粘附频率 F 我具体（一）和非特异性（二）1（红色）和具有约束力10S（蓝色）接触测量与ICAM - 1（A）或hIgG涂层的红细胞粘附之间的反复测试周期的时间（二人中性粒细胞表达整合的α大号β2）F的第 I =（X 1 + X 2 + ... ... + X I）/ I（1≤我≤N），其中 i是试验周期指数，X i等于“1 “ （粘连）或“0”（无粘连），F N（N = 50）被用来作为最佳估计粘连的概率。
图4动力学ICAM - 1结合，以中性粒细胞整合素α 大号β2（ 
）。附着力的概率测量在每个接触时间的细胞对图3所示是平均，并与接触时间绘制。腔介质为1MM的Ca 2 +和Mg 2 +加1μg/ml的二聚体E -选择素免疫球蛋白的HBSS上调α 大号β2结合。为了捕捉ICAM - 1的免疫球蛋白，对红细胞增加了一个中间步骤，孵化链亲和素孵育阶段后的捕获抗体（生物素化山羊抗人Fc的抗体，eBioscience公司）10μg/ml红细胞。为了控制非特异性结合两种不同的条件：1）红细胞与抗人FC捕获抗体涂层和ICAM - 1 - IG（海外）和2）中性粒细胞到红细胞结合，而不是与人IgG孵育与涂层捕获抗体（Δ）。 10μg/ml人IgG添加到中期，以尽量减少E的有约束力- 选择免疫球蛋白溶液中的红细胞表面上的捕获抗体。非特异性结合人IgG控制曲线记录被用来获得一个特定的粘附概率曲线（ 
）式。 2。配件特异性粘附EQ概率曲线。 1（实线）返回有效的结合亲和力一个 c K = 1.4•10 -4μm4 和 K关闭= 0.3 秒 -1 。
| 试剂 | 兆瓦（克/摩尔） | 浓度（毫米） | 量（g） |
|---|---|---|---|
| 腺嘌呤 | 135.13 | 2 | 0.27 |
| D -葡萄糖（葡萄糖） | 180.16 | 110 | 19.82 |
| D -甘露醇 | 182.17 | 55 | 10.02 |
| 氯化钠（NaCl） | 58.44 | 50 | 2.92 |
| 磷酸钠，磷酸氢二铵（NA HPO ） | 141.95 | 20 | 2.84 |
| L -谷氨酰胺 | 146.15 | 10 | 1.46 |
表1的EAS - 45缓冲液配制（1L）。
| 在550μL的DMF XHS 25毫克生物素 | 0.1M素的解决方案 |
| 0.1生物素W / DMF 1:10稀释 | 0.01M素溶液 |
| 1:100稀释的0.1素W / DMF | 0.001M素溶液 |
表2。制备生物素的解决方案。
| 素终浓度（微米） | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 红细胞颗粒股票（μL） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1X PBS（μL） | 179.2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176.8 |
| 0.1M硼酸缓冲液（μL） | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0.01M素溶液（μL） | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001M素溶液（μL） | 0.8 | 2 | 4 |
表3。红细胞生物素。
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Discussion
要成功使用微管粘附频率检测应考虑的几个关键步骤。首先，确保记录的具体利益的受体 - 配体系统的相互作用。非特异性控制测量（参见图3，4）保证的特殊性。理想的情况下，非特异性黏附概率应低于0.05，对所有接触的时间段，每个时间点之间的特异性和非特异性黏附概率有显著差异。不同的方法可以用来夫妇的红细胞表面的配体。结果表明，氯化铬耦合方法17了非特异性结合的生物素-亲和耦合水平高于。
二，为具体互动的附着力概率应在中间范围内。可满足这一要求，由不同的受体和配体（或红细胞只配体的密度，如果是组成细胞表达受体S的密度，这是很难改变）。为此，当测试一个新的系统与未知的受体 - 配体结合的亲和力，准备生物素标记的红细胞的范围（见表三）作为一个例子来测试各种配体密度。稳态粘连的概率应不超过平均0.8细胞的细胞受体密度的变化，往往会带来一些细胞粘附水平为1，如果平均配基密度过高。特异性的初步测试期间，如果某些细胞有0或1的附着力水平，配基密度的需要进行调整。非特异性控制测量通常遵循的具体测量，在这里，人们希望有粘连的概率为尽可能接近零。
第三，找到正确的范围内的接触时间。如果接触时间足够长，EXP（ - K 关闭 吨 ）式中的任期。 1变为零，有效的2D亲和力可以从高原水平计算粘附曲线1： 
关闭率 k 关闭决定的过渡阶段，如何快速的粘附曲线达到一个高原水平。要准确估计，关闭率需要在高原的水平，以及在过渡阶段有足够的时间点，几个点的测量。会计之一以上描述的三个关键步骤，将获得类似约束力的曲线图。 4。
剩下的任务是使用一种受体 - 配体结合动力学模型来解释实验测得的结合曲线和二维动力学参数估计的数据拟合模型的预测。应该指出，式。 1代表第二顺序前进的最简单的模型，第一顺序相反，单步，一个单一的受体-配体的物种之间的可逆动力学。更复杂的动力学过程已被描述，包括日双受体-配体3,4种，分两个阶段约束力无14 19三分子的相互作用，以及活跃的地盘平整工程，而不是债券动力学 10有限的粘附动力学或发送案件。在这种情况下，需要更多地参与数学模型与粘连的概率与接触时间曲线和受体 - 配体结合动力学。
受体 - 配体相互作用的动力学持续的兴趣源于动力学参数的基本假设，即发挥的作用，在确定细胞内下游信号事件。这里介绍的是微管粘附频率检测的很少的方法，允许在实地测量的二维（2D）结合动力学之一。细胞表面受体和配体的二维手段，自然发生在许多细胞与细胞内的生物体的相互作用。 2D受体LIG动力学速率常数和有约束力的细胞如何迅速对方或细胞外基质结合提供的信息，只要他们还是装订成册，多少债券的形式。相比之下，23相互作用的分子之一的表面等离子体共振（SPR）方法是在流体相，因此被称为三维（3D）结合。纯化因为这两个相互作用的分子和细胞环境隔离，在三维测量中获得的动力学参数，可以极大地从不同的二维测量获得的，即使是相同的受体 -配体对17。
粘附频率法分析二维动力学和生活细胞膜，从而提供了一个机会一个分析细胞环境的生物物理和生物化学法规。这些措施包括膜microtopology 5，膜锚2，分子取向和长度为6，载体刚度9和曲率TURE 20，冲击力20，和细胞骨架和膜组织相互作用的分子居住15,17调制器。
由于跨交界的受体 - 配体相互作用需要两个单元，并在两个单元之间的物理联系的结果之间的直接身体接触，分子间相互作用的化学反应动力学，可以分析由机械的检测，使细胞在接触检测效果具有约束力武力。我们虽然体现作为粘附传感器使用一个微管吸气红细胞的粘附频率检测，可用于其他力的技术，包括原子力显微镜24，8,17生物膜力探针，光学镊子25，集成的微管和悬臂26。
其他机械为基础的二维分析得到了发展。这些措施包括热波动检测8，离心TION检测27,28，玫瑰花环法29，流量室检测30,31。
粘附频率分析的局限性是由于反复串行测试一次联络了一双单细胞周期的检测缓慢和劳动密集性质。它变得缓慢关闭率的受体 - 配体相互作用困难的，因为长期接触时间将需要的结合曲线达到稳态，使实验inhibitively长。
由微管吸气RBC构造力传感器能够检测piconewton级力量，这是一个幅度低于一个非共价键的受体-配体键 1,32的典型实力。然而，受体 - 配体的解离可能发生，即使在零力量。任何薄弱的附着力，在不知不觉中导致低估的结合亲和力和率 1 。
T他粘附频率的方法假设每个附着力测试是相同的，独立于其他。这项规定可能会违反一些系统33，在当前的附着力增加或减少未来的附着力的概率。检查的要求，如果遇到粘附事件的记录序列的Matlab代码可应要求提供。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由NIH的拨款R01HL091020，R01HL093723，R01AI077343，并R01GM096187支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
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