Summary
Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.
Abstract
De micropipet hechting test werd ontwikkeld in 1998 tot twee-dimensionale (2D) receptor-ligand bindingskinetiek een te meten. De test maakt gebruik van een menselijke rode bloedcellen (RBC) als hechting sensor en presenterende cel voor een van de interagerende moleculen. Er werken micromanipulatie aan de RBC in contact te brengen met een andere cel die de andere interactie molecuul tot uitdrukking met precies gecontroleerde zone en tijd in een band de vorming mogelijk te maken. De hechting gebeurtenis wordt gedetecteerd als RBC rek op te trekken de twee cellen uit elkaar. Door het controleren van de dichtheid van de liganden geïmmobiliseerd op het oppervlak van RBC, is de kans op aanhechting bewaard in mid-range tussen 0 en 1. De hechting kans is geschat op basis van de frequentie van hechting gebeurtenissen in een opeenvolging van herhaald contact cycli tussen de twee cellen voor een bepaalde tijd contact. Het variëren van de contacttijd genereert een bindend curve. Montage van een probabilistisch model voor receptor-ligand reactiekinetiek 1 tot en met de bindendecurve geeft de 2D-affiniteit en off-rate.
De test is gevalideerd met behulp van interacties van Fcγ-receptoren met IgG Fc 1-6, selectines met glycoconjugaat liganden 6-9, integrines met liganden 10-13, homotypical cadherine binding 14, T-cel-receptor en coreceptor met peptide-major histocompatibility complexen 15 - 19.
De methode is gebruikt om de regelgeving van 2D-kinetiek te kwantificeren door biofysische factoren, zoals het membraan microtopology 5, membraan anker 2, moleculaire oriëntatie en lengte 6, vervoerder stijfheid 9, kromming 20, en impingement werking 20, evenals biochemische factoren, zoals modulatoren van het cytoskelet en membraan micro-omgeving waar de interagerende moleculen wonen en het oppervlak organisatie van deze moleculen 15,17,19.
De methode is ook gebruikt to onderzoek de gelijktijdige binding van dual-receptor-ligand soorten 3,4, en 19 trimolecular interacties met behulp van een aangepast model 21.
Het grote voordeel van de methode is dat deze studie van receptoren in hun eigen omgeving membraan mogelijk maakt. De resultaten kunnen zeer verschillend zijn van de verkregen die gebruik maken van gezuiverd receptoren 17. Het staat ook studie van de receptor-ligand interacties in een sub-seconde tijdschaal met temporele resolutie ver buiten de typische biochemische methoden.
Ter illustratie van de micropipet hechting frequentie methode, tonen we kinetiek meting van intercellulaire adhesie molecule 1 (ICAM-1) gefunctionaliseerde op RBC binding aan integrine α L β 2 op neutrofielen met een dimeer E-selectine in de oplossing voor α L β 2 te activeren.
Protocol
1. RBC isolatie van de volbloed
- Bereid EAS-45 oplossingen. Afweging van alle ingrediënten uit Tabel I en los op in 100-200ml van DI water. Voeg water toe om 1000ml oplossing te maken en de pH aan te passen aan 8,0. Filter en aliquot van 50ml. Invriezen bij -20 ° C voor opslag.
Opmerking: Stap 1.2 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional, zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurde protocol.
- Teken 3-5ml van bloed uit de mediaan cubitaal ader in een 10ml tube met EDTA en voorzichtig mengen onmiddellijk het bloed met EDTA en grondig om te voorkomen dat stolling.
- Proces bloedmonster zo spoedig mogelijk. Al de volgende stappen, behalve centrifugeren moet worden gedaan onder de motorkap te houden de voorbereiding steriel. Overdracht van het bloed om een 50 ml centrifugebuis, voeg 10 ml koud en steriel Histopaque 1077 en centrifugeer 5 min @ 1000 tpm, 4 ° C. Tweemaal herhalen.
- Voeg 10ml koud en steriel PBS, centrifuge voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Verwijder het supernatant. Herhaal dit vier maal (totaal 5 keer).
- Wassen met steriele EAS-45 (5min @ 1000 tpm, 4 ° C) twee keer. Tijdens de laatste wassen zet RBC naar een nieuwe steriele 15 ml buis.
- Resuspendeer RBC in10ml EAS-45.
2. RBC biotinylatie
- Neem de tube met RBC vanaf stap 1. Verwijder alle supernatant na centrifugeren voor 5min @ 1000 tpm, 4 ° C. Doe 10μl van RBC pellet aan elk van de verschillende flesjes en voeg overeenkomstige hoeveelheid PBS aan elke injectieflacon (zie tabel II van bijvoorbeeld de voorbereiding van zes verschillende RBC biotinylering concentraties).
- Het maken van verse Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 verdunningen volgens tabel II.
- Voeg 10μl van 0,1 M boraatbuffer aan elke flacon.
- Voeg berekende hoeveelheid biotine oplossing voor elke flacon (zie tabel II als voorbeeld) en vortex onmiddellijk.
- Plaats elke RBC flaconin een 50 ml conische buis en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was elke flacon 3 keer met 800μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm.
- Voeg 100μl van EAS-45 aan elk flesje en bewaar bij 4 ° C. In elk 1μl van de uiteindelijke oplossing nu moet worden ~ 1mln van RBC.
3. Functionaliseren de biotine-linked liganden * op RBC
- Bereid 2mg/ml streptavidine oplossing volgens instructies van de fabrikant. Aliqouted oplossing kan worden bewaard bij -20 ° C.
- Meng een gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 2.7 (10μl) met streptavidine-oplossing, vortex onmiddellijk op rotator voor 30 minuten incuberen bij 4 ° C.
- Was drie keer met 500μl van EAS-45 voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl EAS-45 / 1% BSA voor opslag.
- Meng gelijke hoeveelheid van RBC uit stap 3.3 (10μl) met een 20μg/ml ligand-oplossing, vortex onmiddellijk en incubeer op rotator voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was twee keer met 500μl van EAS-45 / 1% BSA voor 2min @ 2000 tpm. Voeg 15μl van EAS-45 / 1% BSA voor opslag.
* Als uw eiwit heeft geen biotine link kunt u gebruik maken van een van de commercieel verkrijgbare kits voor eiwit biotinylatie (bijvoorbeeld, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-biotinylatie Kit) of het gebruik gebiotinyleerde het vastleggen van antilichamen als een tussenstap zoals getoond in de video.
4. Kwantificering van de receptor en ligand dichtheden
- Incubeer ligand-coated RBC uit stap 3 en, in een ander flesje, receptor-dragende cellen met verzadigende concentraties van de respectieve mAbs voor 30min bij kamertemperatuur. Incubeer in afzonderlijke flacons cellen met irrelevante isotype-gematchte antilichamen voor controle. Als de primaire antilichamen worden niet fluorescent gelabelde, incubeer met fluorescent-geconjugeerde secundaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant.
- Analyseren van monsters bereid in stap 4.1 met flow cytometery met bijbehorende TL-calibration kralen. Bereken de dichtheden zoals getoond in Fig. 1.
5. Voorbereiding voor micropipet en cel kamer
- Trek micropipetten uit capillaire buizen met behulp van PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode Horizontale Puller of Sutter Instrumenten Micropipet Puller.
- Gebruik micromanipulator met microforge aan het uiteinde van de getrokken micropipet aan te passen aan een gewenste grootte (meestal de gewenste diameter varieert van 1-5 urn afhankelijk van de grootte van de cellen om gebruikt te worden in de studie).
- Bereid de cel kamer door te snijden microscoop Dekglas tot het gewenste formaat. Afdichting van de kamer gebruik van minerale olie aan beide kanten tot middelgrote verdamping te voorkomen om de osmolariteit veranderen tijdens het experiment.
- Voeg de receptor-en ligand-dragende cellen naar de kamer.
6. Micropipet hechting frequentie test
- Aspireren van de interactie cellen door respectieve pipetten en gebruiken de computer geprogrammeerde piezoelectr ic vertaler van de RBC in-en uitrijden van het contact met de andere cel met gecontroleerde contactoppervlak en tijd. Detect hechting gebeurtenissen door het observeren van RBC rek bij de cel scheiding.
- Herhaal de contact-retractie cyclus 50-100 keer voor een bepaalde tijd contact. Noteer de waargenomen hechting gebeurtenissen door het toevoegen van "1" voor hechting of "0" voor geen hechting in een kolom van Excel-spreadsheet. U kunt gebruik maken van een opname-apparaat, bijvoorbeeld, digitale media of videoband, voor de microscopische beelden.
- Noteer de hechting frequentie versus contact opnemen met de tijd curve met behulp van ten minste drie verschillende cel-paren voor elk contact de tijd om een gemiddelde en SEM te verkrijgen.
- Noteer de niet-specifieke binding curve voor de controle met behulp van rode bloedcellen bedekt met irrelevante liganden (bijv. BSA) en / of blokkeren van de liganden of receptoren met behulp van hun specifieke functionele blokkade mAb's. Specifieke hechting frequentie bij elk contact tijdstip kan worden berekend door verwijdering van de niet-specifieke aanhechting frequentie 1.
- Passen bij de specifieke hechting frequentie P versus een contact tijd t gegevens door een probabilistische model (vergelijking 1) dat een tweede-orde naar voren en eerste-orde omgekeerd, single-step interactie tussen een enkele soort van receptoren en een enkele soort van liganden 1 beschrijft :
waar K een is de 2D-effectieve bindingsaffiniteit, k is uit de off-rate, m r en l m zijn de respectieve receptor en ligand dichtheden gemeten in stap 4, en A c is het contactoppervlak. De curve-fit heeft twee parameters, A c K a en k off, als een C en K een hoop worden gegooid bij elkaar en riep samen zo effectief 2D-affiniteit. Het product met de off-rate is het effectieve 2D on-tarief: A c k op = A c K een x k off.
De specifieke hechting frequentie P een wordt berekend door aftrek van de niet-specifieke aanhechting fractie (P-specifieke) van de totale gemeten hechting (P gemeten) 1,21:
8. Representatieve resultaten:
Figuur 1 Bepaling van de integrine α L β 2 site dichtheid op neutrofielen. Neutrofielen werden eerst geïncubeerd met 1μg/ml van E-selectine-Ig voor 10min aan de experimentele conditie gebruikt worden in de figuren 3,4 of zonder E-selectine-Ig wedstrijd, en vervolgens met verzadigende concentraties (10μg/ml) van PE-geconjugeerd anti -menselijke CD11a mAb (kloon HI111, zie Tabel van specifiekereagentia en apparatuur) of irrelevant muis lgG1 voor controle, gewassen, en geanalyseerd onmiddellijk. Monsters werden gelezen op BD LSR flowcytometer met standaard QuantiBRITE PE-kalibratie kralen. Paneel A toont fluorescentie histogrammen van de kalibratie kralen (roze) samen met die van E-selectine-Ig behandeld (blauwe kleur) of onbehandelde cellen (groene kleur). Specifieke CD11a mAb kleuring is getekend in volle bochten en irrelevante isotype-gematchte controle antilichaam kleuring wordt weergegeven in stippellijnen. Cellen behandeld met E-selectine-Ig (aanwezigheid in alle wasstappen en in FACS buffer) had geen invloed op de CD11a dichtheid gezien vanaf de vergelijking met onbehandelde cellen. Paneel B toont het proces van dichtheid van kwantificering. Log10 werd berekend voor de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (FI) van elke piek waarde van vier kalibratie kraal histogrammen uit Panel A (roze cirkels) en voor het perceel-specifieke PE moleculen per kraal (van de fabrikant). Een lineaire regressie van Log10 PE moleculen per kraal tegen Log10 fluoresclingen werd uitgezet. Voor E-selectine behandelde cellen de Log10 FI (y)-waarden gelijk zijn 3,99 (blauw rondje) en 2,23 (blauw open cirkel) voor specifieke mAb en controle antilichaam, voor respectievelijk. We losten de lineaire vergelijking voor x (waarden worden uitgezet als groene en blauwe cirkels op Paneel B) x = Log10 PE / cel en, zoals PE:. MAb-verhouding was 1:1, het totaal aantal α L β 2 op neutrofielen werd berekend als 9587. Oppervlaktedichtheid werd berekend op 43 moleculen / um 2, met behulp van 8.4μm als de neutrofielen diameter 22. Dichtheid van ICAM-1 werd eveneens gemeten met flow cytometery gebruik van PE-anti-humaan CD54 mAb, die 65 mol / um 2 geëvenaard.
Figuur 2 Micropipet systeem schema's. Ons micropipet systeem werd geassembleerd in huis en bestaat uit drie subsystemen: een imaging subsysteem om een te observeren, record en analyseren van de bewegingen van de micropipet-opgezogen cel; een micromanipulatie subsysteem om een om de cellen uit de cel te selecteren kamer, en een druk subsysteem om een om de cellen te zuigen in de micropipetten. Het centrale stuk van de beeldvorming subsysteem is omgekeerde microscoop (Olympus IMT-2 IMT2) met een 100x olie-immersie 1,25 NA doelstelling. Het beeld wordt naar een videorecorder door middel van een heffing paar apparaat (CCD) camera. Een video timer is gekoppeld aan het systeem voor het bijhouden van de tijd. Elke micropipet kan worden gemanipuleerd door een mechanische aandrijving gemonteerd op de microscoop en fijn geplaatst met een drie-assige hydraulische micromanipulator. Mechanische manipulatoren van Newport konden worden gebruikt. Een van de micropipet houders is gemonteerd op een piëzo-elektrische vertaler, is de chauffeur van die gecontroleerd wordt door een computer LabView code (beschikbaar op aanvraag) en het signaal vertaalt door middel van een DAQ bord via een spanning versterker (zelfgemaakte) naar de piezo actuator. Dit is eenllows een om de pipet te verplaatsen nauwkeurig en herhaalbaar in een hechting testcyclus. De drukregeling subsysteem wordt gebruikt om te zuigen controle tijdens het experiment. Een hydraulische lijn verbindt de micropipet houder een vloeistof reservoir. Een fijne mechanische klepstandsteller kan de hoogte van het reservoir om precies te zijn gemanipuleerd.
Micropipetten zijn gegenereerd met behulp van KIMAX smeltpunt borosilicaatglas capillaire buizen (met een buitendiameter van 1,0 ± 0,07 mm en een binnendiameter van 0,7 ± 0,07 mm. Ten eerste, de micropipetten van capillairen worden getrokken met behulp van de norm PN-30 Magnetic Glass Narishige 'micro-elektrode horizontaal Puller (Sutter Instruments Micropipet Puller is een andere trekker optie). Ten tweede, Microforge systeem (gebouwd in huis) wordt gebruikt om de micropipetten tot de gewenste grootte van de opening te snijden. Commerciële modellen van Microforge systemen zijn ook beschikbaar.
Voor trillingen van de micropipetten voorkomen dat tijdens het experiment, de Microscopa, samen met de micromanipulators, wordt geplaatst op een luchtvering tafel.
Figuur 3 Running hechting frequentie F i voor specifieke (A) en niet-specifieke (B) binding op 1s (rood) en 10s (blauw) contact tijden gemeten vanaf herhaald hechting testcycli tussen RBC's bedekt met ICAM-1 (A) of Higg (B ) met menselijke neutrofielen uiten van integrine α L β 2. F i = (X 1 + X 2 + ... + X i) / i (1 ≤ i ≤ n), waarbij i de testcyclus index, X i is gelijk aan "1" (adhesie) of "0" (geen adhesie). F n (n = 50) werd gebruikt als de beste schatting voor de hechting waarschijnlijkheid.
Figuur 4 De kinetiek vanICAM-1 binding aan neutrofielen integrine α L β 2 ( 
). Gemeten hechting waarschijnlijkheid zoals getoond in figuur 3 voor de drie cellen paren op elk contact is gemiddeld en uitgezet tegen contact met de tijd. De kamer medium werd HBSS met 1 mM elk van Ca 2 + en Mg 2 + plus 1μg/ml van dimeer E-selectine-Ig aan α L β upregulate 2 bindend. Voor het vastleggen van ICAM-1-Ig op rode bloedcellen, een tussenstap werd toegevoegd aan RBC incuberen met 10μg/ml capture antilichaam (gebiotinyleerd geit-anti-humaan Fc antilichaam, eBioscience) na de streptavidine incubatie stap. Om te controleren voor niet-specifieke binding twee verschillende condities werden gebruikt: 1) RBC bekleed met de anti-mens-Fc capture antilichaam en geïncubeerd met humaan IgG in plaats van ICAM-1-Ig (O) en 2) neutrofielen binden aan RBC niet bedekt met de capture antilichaam (Δ). 10μg/ml menselijk IgG werd toegevoegd aan het medium te minimaliseren binding van E-Selectine-Ig in oplossing om de capture antilichaam op de RBC oppervlak. Niet-specifieke binding opgenomen als menselijk IgG regelcurve werd gebruikt om een specifieke hechting kans curve te verkrijgen ( 
) Met behulp van Eq. 2. Montage van de specifieke hechting kans curve met Eq. Een (vaste lijn) terug effectieve bindingsaffiniteit A c K a = 1,4 • 10 -4 μm4 en k off = 0,3 s -1.
| Reagens | MW (g / mol) | Concentratie (mM) | Hoeveelheid (g) |
|---|---|---|---|
| Adenine | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-glucose (dextrose) | 180,16 | 110 | 19,82 |
| D-Mannitol | 182,17 | 55 | 10,02 |
| Natriumchloride (NaCl) | 58,44 | 50 | 2,92 |
| Natriumfosfaat, tweebasisch (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-glutamine | 146,15 | 10 | 1,46 |
Tabel 1. EAS-45 buffer voorbereiding (1L).
| 25 mg biotine-XHS in 550 ul van DMF | 0,1 M biotine-oplossing |
| 1:10 verdunning van 0,1 biotine w / DMF | 0,01 M biotine-oplossing |
| 1:100 verdunning van 0,1 biotine w / DMF | 0.001m biotine-oplossing |
Tabel 2. Voorbereiding van de biotine-oplossing.
| biotine uiteindelijke concentratie (uM) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RBC pellet voorraad (pl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (pl) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0,1 M boraatbuffer (pl) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0,01 M biotine-oplossing (pl) | 1 | 2 | 3.2 | |||
| 0.001m biotine-oplossing (pl) | 0.8 | 2 | 4 |
Tabel 3. Biotinylering van RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met succes gebruik van de micropipet hechting frequentie test moet men overwegen een aantal kritische stappen. Controleer eerst of de specifieke interactie van de receptor-ligand systeem van belang vast te leggen. Niet-specifieke controle metingen (zie Fig. 3, 4) zorgen voor de specificiteit. Idealiter zou niet-specifieke aanhechting waarschijnlijkheden lager zijn dan 0,05 voor alle contact tijd duur en om een significant verschil tussen de specifieke en niet-specifieke aanhechting kansen voor elk tijdstip te hebben. Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om enkele van de liganden aan de RBC's oppervlak. Er werd aangetoond dat chroom chloride koppeling methode 17 een hoger niveau van niet-specifieke binding dan biotine-streptavidine koppeling gaf.
Ten tweede moet een hechting kans voor specifieke interactie in het midden bereik. Deze eis kan worden voldaan door het variëren van de dichtheid van receptoren en liganden (of alleen liganden op RBC als receptoren zijn constitutief tot expressie op cels de dichtheid van die moeilijk te veranderen). Voor dit doel, bij het testen van een nieuw systeem met onbekende receptor-ligand bindingsaffiniteit, bereiden een reeks van gebiotinyleerd RBC's (zie Tabel III als een voorbeeld) om een verscheidenheid van ligand dichtheden te testen. De steady-state hechting waarschijnlijkheid moet niet meer dan 0,8 gemiddeld als cel-cel-receptor dichtheid variatie meestal brengt de hechting niveau van bepaalde cellen om een als de gemiddelde ligand dichtheid is te hoog. Tijdens de eerste testen op specificiteit, als sommige cellen hebben hechting niveaus van 0 of 1, het ligand dichtheid moet worden aangepast. Niet-specifieke controle metingen meestal volgen de specifieke metingen en hier men zou willen om de hechting waarschijnlijkheid zo dicht mogelijk bij nul.
Ten derde, vindt het juiste bereik voor de contactpersoon tijden. Als het contact lang genoeg is de exp (- k off t) term in Eq. 1 gaat naar nul en de effectieve 2D-affiniteit kan worden berekend vanaf het plateau niveauvan de hechting curve 1: 
De off-rate k bepaalt uit de overgangsfase of hoe snel de hechting curve reikt tot een plateau niveau. Voor een schatting van het off-rate precies nodig metingen van een aantal punten op een plateau niveau als genoeg tijd punten in de overgangsfase. De verantwoording van de drie kritische hierboven beschreven stappen zal men verkrijgen binding bochten vergelijkbaar met Fig. 4.
De resterende taak is om een receptor-ligand bindingskinetiek model te gebruiken om de experimenteel gemeten binding curve te interpreteren en om van 2D-kinetische parameters schatten uit het monteren van de voorspelling model aan de gegevens. Opgemerkt moet worden dat Eq. 1 staat voor een eenvoudigste model van de tweede-orde naar voren, de eerste orde omgekeerd, single-step, omkeerbare kinetiek tussen een receptor-ligand soorten 1. Meer complexe kinetische processen zijn beschreven, met inbegrip van ee gevallen van dubbele receptor-ligand soorten 3,4, twee-traps binding, zonder 14 of met 19 trimolecular interacties, en hechting kinetiek beperkt door de actieve site vorming in plaats van een obligatie-kinetiek 10. In deze gevallen, meer betrokken zijn mathematische modellen nodig zijn om de hechting kans vs contact tijd curve en de receptor-ligand binding kinetiek betrekking hebben.
De aanhoudende belangstelling voor de kinetiek van receptor-ligand interactie komt voort uit de fundamentele hypothese dat kinetiek parameters een rol spelen bij het bepalen van de downstream signalering gebeurtenissen binnen de cel. De micropipet hechting frequentie test hier gepresenteerde is een van de weinige methoden die het mogelijk maken in situ metingen van de twee-dimensionale (2D) bindingskinetiek. Twee-dimensionale betekent dat beide receptoren en liganden zijn op het celoppervlak, zoals van nature in veel cel-cel interacties binnen in het organisme. De 2D-kinetische snelheidsconstanten van receptor-LIGen bindende informatie te verstrekken over hoe snel cellen binden aan elkaar of aan de extracellulaire matrix, hoe lang ze blijven gebonden, en hoeveel obligaties zullen vormen. Ter vergelijking, in de Surface Plasmon Resonance (SPR) methode 23 een van de interagerende moleculen in de vloeistof fase, vandaar de naam driedimensionale (3D) bindend. Omdat beide interagerende moleculen worden gezuiverd en geïsoleerd van de cellulaire omgeving, kan de kinetische parameters verkregen in 3D-meting worden drastisch verschillen van die verkregen in 2D-metingen, zelfs voor dezelfde receptor-ligand paar 17.
De hechting frequentie methode analyseert 2D-kinetiek op levende cel membraan en dus biedt de mogelijkheid voor een tot de biochemische en biofysische regelgeving van de cellulaire omgeving te analyseren. Deze omvatten het membraan microtopology 5, membraan anker 2, moleculaire oriëntatie en lengte 6, carrier stijfheid 9 en Curvatuur 20, impingement kracht 20, en modulatoren van het cytoskelet en membraan organisatie waar de interagerende moleculen bevinden 15,17.
Omdat de cross-junctions receptor-ligand interactie vereist direct fysiek contact tussen de twee cellen en resulteert in een fysieke koppeling tussen twee cellen, kan de chemische reactie kinetiek van moleculaire interactie geanalyseerd worden door een mechanische test die de cellen in contact brengt en detecteert binding door het effect van kracht. Hoewel we een voorbeeld van de hechting frequentie test met behulp van een micropipet-geaspireerde RBC als een hechting sensor, kunnen andere kracht technieken worden gebruikt, inclusief atomic force microscopie 24, biomembraan kracht sonde 8,17, optische pincet 25, en de geïntegreerde micropipet en cantilever 26.
Andere mechanisch-based 2D-testen zijn ontwikkeld. Deze omvatten de thermische fluctuatie assay 8, centrifugaTION assay 27,28, rosetting assay 29, en flow kamer assay 30,31.
De beperking van de hechting frequentie test is de trage en arbeidsintensieve karakter van de test te wijten aan de herhaalde serial cycli met een enkel paar van cellen getest een contact per keer. Het wordt moeilijk voor receptor-ligand interacties met trage off-koersen lange contact tijd nodig zou zijn voor de binding curve te bereiken steady-state, waardoor het experiment inhibitively lang.
De kracht transducer gebouwd door een micropipet-geaspireerde RBC is in staat om voor het detecteren van piconewton-level krachten, die een orde van grootte lager dan de typische kracht van een niet-covalente receptor-ligand binding 1,32. Echter, receptor-ligand dissociatie kan ook optreden op nul krachten. Eventuele zwakke hechting die onopgemerkt leidt gaat naar een onderschatting van de bindingsaffiniteit en on-tarief 1.
Thij hechting frequentie methode gaat ervan uit dat elke hechting test is identiek en onafhankelijk van de anderen. Deze eis zou kunnen worden geschonden zoals werd aangetoond voor sommige systemen 33, waar de huidige hechting verhoogd of verlaagd de kans op de volgende hechting. De Matlab-code om te controleren of de eis wordt voldaan voor de opgenomen volgorde van de gebeurtenissen hechting is op aanvraag beschikbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de NIH subsidie R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343, en R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
