Summary
Анализ сцепления частоты для измерения рецептор-лиганд кинетики взаимодействия, когда обе молекулы закреплены на поверхностях взаимодействующих элементов описан. Это механически основе анализа является примером использования микропипетки под давлением человеческого эритроцита, как адгезия датчика и интегрина αLβ2 и межклеточной молекулы адгезии-1 в качестве взаимодействующих рецепторов и лигандов.
Abstract
Анализ микропипетки адгезии была разработана в 1998 году для измерения двумерной (2D) рецептор-лиганд кинетики 1. Анализ использования человеческих красных кровяных телец (эритроцитов) в качестве датчика сцепления и представления ячейки для одного из взаимодействующих молекул. В нем занято микроманипуляция принести РБК в контакт с другой ячейке, что выражает другой молекулы, взаимодействующие с точно контролируемой зоне и время для включения образования связей. Адгезии событие определяется как относительное удлинение на РБК тянет две ячейки друг от друга. Контролируя плотность лигандов, иммобилизованных на поверхности эритроцитов, вероятность адгезии находится в середине диапазона между 0 и 1. Адгезии вероятность оценивается по частоте адгезии события в последовательности циклов повторный контакт между двумя ячейками для данного времени контакта. Варьируя время контакта создает обязательную кривой. Установка вероятностную модель для рецептор-лиганд кинетику реакции с 1 по обязательнымкривая возвращает 2D близости и вне курса.
Анализа была подтверждена использованием взаимодействия Fcγ рецепторов IgG Fc 1-6, селектины с гликоконъюгата лигандов 6-9, интегрины с лигандами 10-13, homotypical кадгерина обязательной 14, Т-клеточного рецептора и coreceptor с пептида-майор гистосовместимости комплексов 15 - 19.
Метод был использован для количественного правила 2D кинетики биофизических факторов, таких как мембраны microtopology 5, мембранного якоря 2, молекулярной ориентации и длины 6, перевозчик жесткость 9, кривизна 20, и удар силой 20, а также биохимических факторов, такие как модуляторов цитоскелета и мембраны микросреды, где проживают взаимодействующих молекул и поверхности организации этих молекул 15,17,19.
Метод также используется то изучение одновременного связывания двойной рецептор-лиганд видов 3,4 и тримолекулярных взаимодействия 19 с использованием модифицированной модели 21.
Главным преимуществом метода является то, что она позволяет изучение рецепторов в их родной среде мембраны. Результаты могут существенно отличаться от тех, полученные с использованием очищенных рецепторов 17. Она также позволяет изучение рецептор-лиганд в доли секунды сроки с временным разрешением далеко за рамки типичных биохимических методов.
Для иллюстрации частоты микропипетки адгезии методом, мы показываем кинетики измерения межклеточные молекулы адгезии 1 (ICAM-1) функционализированных на эритроциты привязки к интегрина α L β 2 на нейтрофилы с димерных E-селектина в растворе для активации α L β 2.
Protocol
1. Эритроциты изоляции от цельной крови
- Подготовка EAS-45 решений. Взвесьте все ингредиенты из таблицы, и растворите в 100-200мл воды DI. Добавить воды, чтобы сделать 1000 мл раствора и регулировать рН до 8,0. Фильтр и аликвоты по 50 мл. Замораживание при -20 ° С для хранения.
Примечание: Шаг 1.2 должна проводиться квалифицированным медицинским работником, таких как медсестры, с институциональной наблюдательного совета утвержденным протоколом.
- Нарисуйте 3-5 мл крови из локтевой вены среднего в 10 мл пробирку, содержащую ЭДТА и осторожно смешать кровь с ЭДТА немедленно и тщательно, чтобы избежать образования тромбов.
- Процесс образец крови как можно скорее. Все следующие шаги, кроме центрифугированием должно быть сделано под капотом, чтобы держать подготовки стерильной. Передача крови 50 мл центрифужную пробирку, добавьте 10 мл холодной и стерильной Histopaque 1077 и центрифуга для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Повторите дважды.
- Добавить 10мл холодной и стерильной PBS, центрифуга для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Удалить супернатант. Повторить 4 раза (всего 5 раз).
- Промыть стерильной EAS-45 (5 мин @ 1000rpm, 4 ° С) в два раза. За последние стиральной двигаться эритроцитов в новую стерильную 15 мл пробирку.
- Ресуспендируют эритроцитов in10ml EAS-45.
2. Эритроциты биотинилирование
- Возьмите трубку с эритроцитов, начиная с шага 1. Удалите все супернатант после центрифугирования для 5мин @ 1000rpm, 4 ° C. Поместите 10 мкл эритроцитов гранул для каждого из нескольких флаконов и добавить соответствующее количество PBS в каждом флаконе (см. табл например подготовки шести различных биотинилирование эритроцитов концентрации).
- Сделайте свежие Biotin-X-NHS/DMF 1:10, 1:100 разведения в соответствии с табл.
- Добавить 10 мкл буфера 0,1 М бората для каждого флакона.
- Добавить расчетное количество биотина решение каждого флакона (см. таблицу II в качестве примера) и вихревой немедленно.
- Место каждого флакона РБКв 50 мл коническую трубку и инкубировать на поворотное устройство в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Вымойте каждого флакона 3 раза 800μl ШАЛ-45 для 2min @ 2000rpm.
- Добавить 100 мкл EAS-45 для каждого флакона и хранить при температуре 4 ° C. В каждом из 1 мкл окончательное решение теперь должно быть ~ 1 млн. эритроцитов.
3. Функционализация биотин связанных лигандов * на эритроциты
- Подготовка 2mg/ml стрептавидин решение в соответствии с инструкциями производителя. Aliqouted решение может храниться при температуре -20 ° C.
- Смешайте равное количество эритроцитов, начиная с шага 2.7 (10 мкл) с стрептавидином решение, вихревые немедленно и инкубировать на ротатор в течение 30 минут при 4 ° C.
- Промыть 3 раза с 500 мкл ШАЛ-45 для 2min @ 2000rpm. Добавить 15μl EAS-45 / 1% BSA для хранения.
- Смешайте равное количество эритроцитов, начиная с шага 3.3 (10 мкл) с 20μg/ml решение лиганд, вихревые немедленно и инкубировать на ротатор в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Мыть два раза с 500 мкл ШАЛ-45 / 1% BSA за 2 минуты @ 2000rpm. Добавить 15μl ШАЛ-45 / 1% BSA для хранения.
* Если ваш белок не имеет биотин ссылке вы можете воспользоваться одним из имеющихся в продаже наборов для белка биотинилирование (например, Thermo Scientific # 21955 EZ-Link Micro NHS-PEG4-биотинилирование Kit) или использовать биотинилированного захвата антител в качестве промежуточного шага, как показано в видео.
4. Количественная оценка рецептор и лиганд плотности
- Инкубируйте лиганд-покрытием эритроцитов, начиная с шага 3, и в различных флаконе, несущих рецептор клеток с насыщающей концентрации соответствующих моноклональных антител в течение 30 минут при комнатной температуре. Инкубируйте в отдельных камерах флаконов с неуместной изотипа соответствием антител для контроля. Если первичные антитела не флуоресцентно меченных, инкубировать с флуоресцентно-сопряженных вторичными антителами в соответствии с инструкциями производителя.
- Анализ образцов, полученных в шаге 4,1 потоком cytometery с соответствующими флуоресцентными калibration бисером. Рассчитайте плотности, как показано на рис. 1.
5. Подготовка к микропипетки и клеточной камере
- Потяните микропипетки из капилляров использования PN-30 Магнитные Narishige "Стекло Микроэлектродные Горизонтальное Puller или Саттер инструменты микропипетки Puller.
- Использование микроманипулятора с microforge настроить кончик потянул микропипетки до нужного размера (как правило, требуется диапазонов диаметром от 1-5 мкм в зависимости от размера ячейки, которые будут использованы в исследовании).
- Подготовка ячейки камеры резки стекла микроскопа Обложка до нужного размера. Уплотнение камеры использовании минерального масла с обеих сторон, чтобы избежать испарения средний изменить осмолярность в ходе эксперимента.
- Добавить рецептор-лиганд и несущих клеткам камеры.
6. Микропипетки адгезии частоты анализа
- Аспирируйте взаимодействующих клеток соответствующих пипетки и использовать компьютер запрограммирован piezoelectr IC переводчик ездить РБК и выходить из контакта с другой ячейке с контролируемой зоне контакта и время. Определение сцепления событий, наблюдая РБК удлинение при клетка разделения.
- Повторите контакт-ретракция цикла 50-100 раз для данного времени контакта. Запись наблюдаемых явлений адгезии путем добавления "1" для адгезии или "0" не адгезии в столбце таблицы Excel. Вы можете использовать устройство записи, например, цифровых средств массовой информации или видеозаписи, для микроскопических изображений.
- Запись частоты сцепления по отношению к времени контакта кривой с использованием по меньшей мере три различные пары ячейки для каждого контакта время, чтобы получить среднее и SEM.
- Запись неспецифического связывания кривой для управления с помощью эритроцитов покрыта не имеет значения лигандов (например, BSA) и / или блокирование лигандами или рецепторами, используя их специфические функциональные МАТ блокады. Конкретные частоты адгезии в каждой точке времени контакта могут быть рассчитаны путем удаления неспецифических частоты адгезии 1.
- Установите определенную частоту адгезии Р по сравнению с временем контакта т данных вероятностной модели (уравнение 1), который описывает второго порядка вперед и первого порядка, наоборот, пошагового взаимодействия отдельных видов рецепторов и отдельных видов лигандов 1 :
где К является эффективным 2D сродство, к выключение пределы скорости, м г и т л соответствующих рецепторов и лигандов плотность измеряется в шаге 4, и с-зоны контакта. Кривая посадки имеет два параметра, С К и А прочь, как С и К являются валить в одну кучу, и призвал все вместе как эффективный 2D близости. Ее продукт от курса является эффективным 2D на курс: с к о = С К х к с.
Специфическую адгезию частоты P рассчитывается путем вычитания неспецифического фракция адгезии (Р неспецифический) от общего измеряется адгезии (Р измеряется) 1,21:
8. Представитель Результаты:
Рисунок 1 Определение интегрина α L β 2 сайта плотности на нейтрофилов. Нейтрофилы сначала инкубируют с 1μg/ml Е-селектина-Ig в течение 10 минут, чтобы соответствовать экспериментальных условий, используемых в цифрах 3,4 или без Е-селектина-Ig, а затем с насыщающей концентрации (10μg/ml) ПЭ-сопряженных анти -человек CD11a МКА (Clone HI111, см. таблицу конкретныхреактивов и оборудования) или не имеют отношения IgG1 мыши для управления, промывают, и проанализированы немедленно. Образцы читать BD LSR потока цитометр со стандартными бисером QuantiBRITE PE калибровки. Группа показывает флуоресценции гистограммы калибровки шариков (розовый) вместе с теми, Е-селектина-Ig лечение (синего цвета) или необработанных клетках (зеленый цвет). Конкретные CD11a мАт окрашивания показана на сплошные линии и неуместные изотипа соответствием окрашивания контроль антител показано на пунктирной кривой. Клетки обрабатывали E-селектина-Ig (присутствие во всех стиральных шаги и в буферных FACS) не влияет на плотность CD11a как видно из сравнения с необработанными клетками. Группа B показан процесс плотности количественной оценке. Log10 была рассчитана для средней интенсивности флуоресцентного (FI) каждого пиковое значение из четырех калибровки гистограммы борт от группы (розовые кружки) и для многих конкретных PE молекул в шарик (от производителя). Линейной регрессии Log10 молекул полиэтилена в шарик против Log10 fluorescENCE была снята. Для E-селектина обработанных клеток Log10 FI (у) значений, равных 3.99 (синий сплошной кружок) и 2.23 (синий открытый круг) для конкретных МАБ и контроль антител, respectivly. Мы решили линейное уравнение для х (значения приведены в виде зеленых и синих кругов на группы В) х = Log10 PE / клеток и, как полиэтилен. МАт соотношение было 1:1, общее количество α L β 2 на нейтрофилов рассчитывается как 9587. Поверхностная плотность рассчитывалась для 43 молекул / мкм 2, используя 8.4μm как диаметр нейтрофилов 22. Плотность ICAM-1 было так же измеряется поток cytometery использованием PE-анти-CD54 МКА человека, который составил 65 моль / мкм 2.
На рисунке 2 схемы микропипетки системы. Наши микропипетки система собиралась в доме и состоит из трех подсистем: подсистемы визуализации чтобы можно было наблюдать, рекомендацияог и анализа движения микропипетки атмосферный клетки; микроманипуляция подсистемы, чтобы можно было выбрать ячейки от ячейки камеры, и давление подсистемы позволяют аспирации клеток в микропипетки. Центральная часть подсистемы визуализации инвертированного микроскопа (Olympus IMT-2 IMT2) с 100х масляной иммерсии 1,25 цель NA. Изображение передается на кассетный видео через прибор с зарядовой пара (ПЗС) камеры. Видео таймер соединен с системой, чтобы следить за временем. Каждый микропипетки могут манипулировать механический привод монтируется на микроскоп и мелко позиционируется с трехосной гидравлического микроманипулятора. Механические манипуляторы из Ньюпорта могут быть использованы также. Один из микропипетки держателей устанавливается на пьезоэлектрический переводчик, водитель которого находится под контролем компьютера LabView код (предоставляется по запросу), а сигнал переводит через борт DAQ через усилитель напряжения (самодельный) на привод пьезо. Этоllows один двигаться пипеткой точно и repeatably в цикл испытаний адгезии. Подсистема регулирования давления используется для контроля всасывания в ходе эксперимента. Гидравлическая линия соединяет микропипетки владельцу, резервуар для жидкости. Тонкой механической позиционер позволяет высота резервуара точно манипулировать.
Микропипетки генерируются с использованием Kimax плавления боросиликатного стекла капилляров (с внешним диаметром 1,0 ± 0,07 мм и внутренним диаметром 0,7 ± 0,07 мм. Во-первых, микропипетки из капилляров тянут использования PN-30 Магнитные Narishige "Стекло Микроэлектродные Горизонтальное Puller (Саттер инструменты микропипетки Puller другой съемник опция). Во-вторых, Microforge системы (построен в дом) используется для резки микропипетки до нужного размера отверстия. Коммерческие модели систем Microforge также доступны.
Для того чтобы избежать вибрации микропипетки в ходе эксперимента, microscОПЕ, наряду с микроманипуляторами, помещается на стол пневматическая подвеска.
Рисунок 3 Запуск F адгезии частоте я для конкретных (А) и неспецифические (B) обязательным на 1 сек (красный) и 10 с (синий) времени контакта измеряется от повторяющихся циклов испытаний адгезии между эритроцитов покрыта ICAM-1 (А) или hIgG (B ) с нейтрофилов человека выразить интегрина α L β 2. F я = (X 1 + X 2 + ... + X я) / я (1 ≤ ≤ п), где я есть индекс испытательного цикла, X я равным «1» (адгезия) или "0" (без сцепления). F п (п = 50) был использован в качестве наилучшей оценки для адгезии вероятности.
Рисунок 4 КинетикаICAM-1 привязки к нейтрофилов интегрина α L β 2 ( 
). Адгезия вероятность измеряется как показано на рисунке 3 на три ячейки пар на каждый контакт времени усредняется и построены по сравнению с временем контакта. Камера среды HBSS с 1 мМ каждого из Са 2 + и Mg 2 + плюс 1μg/ml димерных E-селектина-Ig к upregulate α L β 2 обязательными. Для захвата ICAM-1-Ig на эритроцитах, промежуточный шаг был добавлен для инкубации эритроцитов с антителами 10μg/ml захвата (биотинилированного козьего анти-человеческий Fc антитела, eBioscience) после инкубации стрептавидин шаг. Для контроля неспецифического связывания двух различных условиях были использованы: 1) эритроцитов покрыта анти-человек-Fc захвата антител и инкубировали с человеческим IgG, а не ICAM-1-Ig (O) и 2) нейтрофилов привязка к БС не покрытые захват антитела (Δ). 10μg/ml человеческого IgG был добавлен в среду, чтобы минимизировать связывание E-Селектина-Ig в растворе, чтобы захватить антител на поверхности эритроцитов. Неспецифическое связывание записан как человеческие кривой IgG контроля был использован для получения конкретной кривой вероятность адгезии ( 
) По формуле. 2. Установка конкретной кривой вероятность адгезии с формулой. 1 (сплошная линия) вернулся эффективное сродство с К = 1,4 • 10 -4 μm4 а к с = 0,3 с -1.
| Реагент | МВт (г / моль) | Концентрация (мМ) | Сумма (г) |
|---|---|---|---|
| Аденин | 135,13 | 2 | 0,27 |
| D-глюкозы (декстрозы) | 180,16 | 110 | 19,82 |
| D-маннитол | 182,17 | 55 | 10,02 |
| Хлорид натрия (NaCl) | 58,44 | 50 | 2,92 |
| Фосфат натрия, Диаммоний (Na HPO ) | 141,95 | 20 | 2,84 |
| L-глютамин | 146,15 | 10 | 1,46 |
Таблица 1. EAS-45 буфер подготовки (1L).
| 25 мг биотин-XHS в 550 мкл ДМФ | 0,1 М раствор биотин |
| 1:10 разбавления 0,1 биотин ж / DMF | 0,01 М раствор биотин |
| 1:100 разбавления 0,1 биотин ж / DMF | 0,001 биотин решение |
Таблица 2. Приготовление раствора биотин.
| биотин конечная концентрация (мкМ) | 4 | 10 | 20 | 50 | 100 | 160 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Эритроциты гранул запаса (мкл) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1x PBS (мкл) | 179,2 | 178 | 176 | 179 | 178 | 176,8 |
| 0,1 М боратном буфере (мкл) | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 0,01 М раствор биотин (мкл) | 1 | 2 | 3,2 | |||
| 0,001 биотин решение (мкл) | 0,8 | 2 | 4 |
Таблица 3. Биотинилирование эритроцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы успешно использовать частоты микропипетки адгезии анализа следует учитывать несколько важных шагов. Во-первых, убедитесь, что для записи конкретного взаимодействия рецептор-лиганд системы интересов. Неспецифические контрольные измерения (см. рис. 3, 4) обеспечить специфичность. В идеале, неспецифические вероятности адгезии должна быть не ниже 0,05 для всех длительности контакта и иметь существенное различие между специфической и неспецифической адгезии вероятности для каждого момента времени. Различные методы могут быть использованы для пары лигандов на поверхности эритроцитов. Было показано, что взаимодействие хлорида хрома методом 17 дал более высокий уровень неспецифического связывания, чем биотин-стрептавидин связи.
Во-вторых, вероятность адгезии для специфического взаимодействия должны быть в середине диапазона. Это требование может быть выполнено путем изменения плотности рецепторов и лигандов (или только лигандов на эритроциты, если рецепторы конститутивно выразил на сотовыес плотностью, которую трудно изменить). Для этого, при тестировании новой системы с неизвестным рецептор-лиганд сродство, подготовить ряд биотинилированного эритроцитов (см. таблицу III в качестве примера) для тестирования различных лигандов плотности. Стационарном адгезии вероятность должна быть не более чем 0,8 в среднем, как клетка-клеточного рецептора изменения плотности обычно приносит адгезии некоторых клеток в 1, если средняя плотность лиганд слишком высока. В ходе первоначального тестирования на специфичность, если некоторые клетки имеют адгезию уровней 0 или 1, лиганд плотность должна быть скорректирована. Неспецифические контрольные измерения обычно следуют конкретные измерения и здесь хотелось бы иметь адгезию вероятность как можно ближе к нулю, когда это возможно.
В-третьих, найти правильный диапазон для контакта раз. Если время контакта достаточно долго, ехр (- к с т) слагаемое в формуле. 1 стремится к нулю, и эффективный 2D близость может быть вычислена по плато на уровнеот адгезии кривая 1: 
От курса к вне определяет фазовый переход, или как быстро адгезии кривая достигает плато уровне. Чтобы оценить пределы скорости точно требует измерений в нескольких точках плато уровне, а также достаточное количество очков время в переходном этапе. Учет три критические шаги, описанные выше, один будет получить кривые связывания, аналогичные рис. 4.
Остальные задачи является использование рецептор-лиганд модель кинетики интерпретировать экспериментально измеренного обязательными кривой и оценить 2D-кинетические параметры установки модели прогнозирования к данным. Следует отметить, что уравнение. 1 представляет собой простейшую модель второго порядка вперед, первого порядка, наоборот, пошагово, обратимые кинетики между одним рецептор-лиганд виды 1. Более сложные кинетические процессы были описаны, в том числе гоэлектронной случаи двойного рецептор-лиганд видов 3,4, двухступенчатая без обязательной 14 или с 19 тримолекулярных взаимодействий, кинетики и адгезию ограничено активное формирование сайт вместо того, чтобы связь кинетики 10. В этих случаях более активно математические модели должны относиться вероятность адгезии против контакта кривой времени и рецептор-лиганд кинетики.
Устойчивый интерес к кинетики рецептор-лиганд взаимодействия проистекает из фундаментального предположения, что кинетика параметры играют роль в определении вниз по течению сигнальных событий внутри клетки. Частота микропипетки адгезии анализа представленных здесь является одним из немногих методов, которые позволяют на месте измерения двумерной (2D) обязательные кинетики. Двумерные означает, что обе рецепторов и лигандов на поверхности клеток, так же естественно, происходит во многих межклеточных взаимодействий внутри организма. 2D кинетических констант скорости рецептор-маяки обязательного предоставления информации о том, как быстро клетки связываются друг с другом или внеклеточный матрикс, как долго они остаются связанными, и сколько облигаций форме. Для сравнения, в поверхностного плазменного резонанса (SPR) метод 23 одного из взаимодействующих молекул в жидкой фазе, следовательно, называется трехмерной (3D) привязки. Поскольку оба взаимодействующих молекул очищаются и изолированы от клеточного окружения, кинетические параметры, полученные в 3D измерение можно радикально отличается от полученных в 2D измерения даже на тот же рецептор-лиганд пара 17.
Метод сцепления частоты 2D анализ кинетики на живые клеточные мембраны и таким образом обеспечивает возможность для одного анализа биофизических и биохимических правила клеточного окружения. К ним относятся мембраны microtopology 5, мембранного якоря 2, молекулярной ориентации и длины 6, перевозчик жесткость 9 и критуры 20, удар силой 20 и модуляторов цитоскелета и мембраны организации, в которой взаимодействующие молекулы проживают 15,17.
Потому что кросс-соединительного рецептор-лиганд взаимодействия требует прямого физического контакта между двумя клетками и приводит к физической связи между двумя клетками, химической кинетики реакции взаимодействия молекул можно анализировать с помощью механического анализа, который ставит клеток в контакт и обнаруживает связывания эффект силы. Хотя мы примере анализа адгезии частоты с помощью микропипетки атмосферный РБК адгезии датчик, другие методы сила может быть использована, в том числе атомно-силовой микроскопии 24, биомембраны силы зонд 8,17, оптический пинцет 25 и интегрированная микропипетки и консольные 26.
Другие механически основе 2D-тесты были разработаны. К ним относятся тепловые анализа флуктуаций 8, центрифугированиемТион анализа 27,28, rosetting анализа 29 и проточную камеру анализа 30,31.
Ограничение анализа частоты адгезия медленный и трудоемкий характер анализа из-за повторяющихся циклов с серийным одна пара клеток испытания одного контакта за один раз. Это становится трудным для рецептор-лиганд с медленным вне ставки, поскольку долгое время контакта потребуются для связывания кривой достичь стационарного, что делает эксперимент inhibitively долго.
Датчик силы построен микропипетки атмосферный РБК способна для обнаружения piconewton уровня силы, которая на порядок ниже, чем типичный силы нековалентных рецептор-лиганд 1,32. Тем не менее, рецептор-лиганд диссоциация может произойти даже при нулевой сил. Любой слабую адгезию, что не обнаруживается приводит к недооценке сродство и на скорости 1.
ТОн метод сцепления частоты предполагает, что каждая адгезии тест идентичны и независимы от других. Это требование может быть нарушено как это было показано для некоторых систем 33, где нынешняя адгезии увеличивается или уменьшается вероятность следующего адгезии. Код Matlab для проверки, если требование считается выполненным по записанной последовательности сцепления событий может быть предоставлена по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 и R01GM096187.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
| Vacutainer EDTA | BD Biosciences | 366643 | RBCs isolation |
| 10ML PK100 | |||
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
| D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
| Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
| Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
| Dimethylformamide (DMF) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20673 | RBCs biotinylation |
| Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21125 | Ligand functionalizing |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette pulling |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
| PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
| Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
| hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-303 | Micropipette system |
| Mechanical manipulator | Newport Corp. | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
| piez–lectric translator | Physik Instruments | P-840 | Micropipette system |
| LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
| DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
| Optical table | Kinetic Systems | 5200 Series | Micropipette system |
References
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
- Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
- Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
- Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
- Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
- Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
- Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
- Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
- Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
- Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
- Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
- Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
- Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 Forthcoming.
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
- Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
- Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
- Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
- Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
- Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
- Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
- Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
- Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
- Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
- Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
- Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
- Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).
