Summary

Hechting Frequency Assay voor In Situ Kinetiek Analyse van de Cross-junctionele moleculaire interacties in de cel-cel-interface

Published: November 02, 2011
doi:

Summary

Een hechting frequentie test voor het meten van receptor-ligand interactie kinetiek wanneer beide moleculen zijn verankerd op het oppervlak van de interagerende cellen is beschreven. Deze mechanisch-gebaseerde test wordt geïllustreerd met behulp van een micropipet-druk menselijke rode bloedcel als adhesie sensor en integrine αLβ2 en intercellulaire adhesie molecuul-1 als interactie-receptoren en liganden.

Abstract

De micropipet hechting test werd ontwikkeld in 1998 tot twee-dimensionale (2D) receptor-ligand bindingskinetiek een te meten. De test maakt gebruik van een menselijke rode bloedcellen (RBC) als hechting sensor en presenterende cel voor een van de interagerende moleculen. Er werken micromanipulatie aan de RBC in contact te brengen met een andere cel die de andere interactie molecuul tot uitdrukking met precies gecontroleerde zone en tijd in een band de vorming mogelijk te maken. De hechting gebeurtenis wordt gedetecteerd als RBC rek op te trekken de twee cellen uit elkaar. Door het controleren van de dichtheid van de liganden geïmmobiliseerd op het oppervlak van RBC, is de kans op aanhechting bewaard in mid-range tussen 0 en 1. De hechting kans is geschat op basis van de frequentie van hechting gebeurtenissen in een opeenvolging van herhaald contact cycli tussen de twee cellen voor een bepaalde tijd contact. Het variëren van de contacttijd genereert een bindend curve. Montage van een probabilistisch model voor receptor-ligand reactiekinetiek 1 tot en met de bindendecurve geeft de 2D-affiniteit en off-rate.

De test is gevalideerd met behulp van interacties van Fcγ-receptoren met IgG Fc 1-6, selectines met glycoconjugaat liganden 6-9, integrines met liganden 10-13, homotypical cadherine binding 14, T-cel-receptor en coreceptor met peptide-major histocompatibility complexen 15 – 19.

De methode is gebruikt om de regelgeving van 2D-kinetiek te kwantificeren door biofysische factoren, zoals het membraan microtopology 5, membraan anker 2, moleculaire oriëntatie en lengte 6, vervoerder stijfheid 9, kromming 20, en impingement werking 20, evenals biochemische factoren, zoals modulatoren van het cytoskelet en membraan micro-omgeving waar de interagerende moleculen wonen en het oppervlak organisatie van deze moleculen 15,17,19.

De methode is ook gebruikt to onderzoek de gelijktijdige binding van dual-receptor-ligand soorten 3,4, en 19 trimolecular interacties met behulp van een aangepast model 21.

Het grote voordeel van de methode is dat deze studie van receptoren in hun eigen omgeving membraan mogelijk maakt. De resultaten kunnen zeer verschillend zijn van de verkregen die gebruik maken van gezuiverd receptoren 17. Het staat ook studie van de receptor-ligand interacties in een sub-seconde tijdschaal met temporele resolutie ver buiten de typische biochemische methoden.

Ter illustratie van de micropipet hechting frequentie methode, tonen we kinetiek meting van intercellulaire adhesie molecule 1 (ICAM-1) gefunctionaliseerde op RBC binding aan integrine α L β 2 op neutrofielen met een dimeer E-selectine in de oplossing voor α L β 2 te activeren.

Protocol

1. RBC isolatie van de volbloed Bereid EAS-45 oplossingen. Afweging van alle ingrediënten uit Tabel I en los op in 100-200ml van DI water. Voeg water toe om 1000ml oplossing te maken en de pH aan te passen aan 8,0. Filter en aliquot van 50ml. Invriezen bij -20 ° C voor opslag. Opmerking: Stap 1.2 moet worden uitgevoerd door een opgeleide medische professional, zoals een verpleegkundige, met een Institutional Review Board goedgekeurde protocol. <ol star…

Discussion

Met succes gebruik van de micropipet hechting frequentie test moet men overwegen een aantal kritische stappen. Controleer eerst of de specifieke interactie van de receptor-ligand systeem van belang vast te leggen. Niet-specifieke controle metingen (zie Fig. 3, 4) zorgen voor de specificiteit. Idealiter zou niet-specifieke aanhechting waarschijnlijkheden lager zijn dan 0,05 voor alle contact tijd duur en om een ​​significant verschil tussen de specifieke en niet-specifieke aanhechting kansen voor elk tijdstip te hebb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Deze studie werd ondersteund door de NIH subsidie ​​R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343, en R01GM096187.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue # Comments
10x PBS BioWhittaker

17-517Q

Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA BD 366643 RBCs isolation
10ML PK100      
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 RBCs isolation
Adenine Sigma-Aldrich A2786 EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 EAS-45 preparation
D-Mannitol Sigma-Aldrich 6360 EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (NaHPO) Fisher Scientific S374 EAS-45 preparation
L-glutamine Sigma-Aldrich G5763 EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS Calbiochem 203188 RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF) Thermo Scientific 20673 RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M) Electron Microscopy Sciences 11455-90 RBCs biotinylation
Streptavidin Thermo Scientific 21125 Ligand functionalizing
BSA Sigma-Aldrich A0336 Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads BD Biosciences 340495 Density quantification
Flow cytometer BD Immunocytometry Systems

BD LSR II

Density quantification

Capillary Tube

0.7-1.0mm x 30"
Kimble Glass Inc. 46485-1 Micropipette pulling
Mineral Oil Fisher Scientific BP2629-1 Chamber assembly
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-544-G Chamber assembly

PE α-human CD11a

Clone HI 111
eBioscience 12-0119-71 Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54 eBioscience 12-0549 Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE eBioscience 12-4714 Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator Narishige MO-303 Micropipette system
Mechanical manipulator Newport 461-xyz-m, SM-13, DM-13 Micropipette system
piezoelectric translator Physik Instrumente P-840 Micropipette system
LabVIEW National Instruments Version 8.6 Micropipette system
DAQ board National Instruments USB-6008 Micropipette system
Optical table Kinetics Systems 5200 Series Micropipette system

References

  1. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).
  2. Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16). J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).
  3. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG. Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).
  4. Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2. Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).
  5. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).
  6. Huang, J. Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics. J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).
  7. Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions. Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).
  8. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophys. J. 94, 694-701 (2008).
  9. Wu, L. Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions. J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).
  10. Waugh, R. E., Lomakina, E. B. Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1. Biophys. J. 96, 268-275 (2009).
  11. Zhang, F. Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain. J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).
  12. Lomakina, E. B., Waugh, R. E. Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects. Biophys. J. 96, 276-284 (2009).
  13. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).
  14. Chien, Y. H. Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region. J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).
  15. Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane. J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).
  16. Wasserman, H. A. MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1. J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).
  17. Huang, J. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 .
  18. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).
  19. Jiang, N. Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination. Immunity. 34, 13-23 (2011).
  20. Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).
  21. Zhu, C., Williams, T. E. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).
  22. Downey, G. P. Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability. J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).
  23. Li, P. Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands. J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).
  24. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).
  25. Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis. Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).
  26. Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules. Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).
  27. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophys. J. 74, 492-513 (1998).
  28. Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors. Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).
  29. Long, M. Probabilistic modeling of rosette formation. Biophys. J. 91, 352-363 (2006).
  30. Lou, J. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).
  31. Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear. Biophys. J. 92, 330-342 (2007).
  32. Evans, E., Berk, D., Leung, A. Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments. Biophys. J. 59, 838-848 (1991).
  33. Zarnitsyna, V. I. Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zarnitsyna, V. I., Zhu, C. Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface. J. Vis. Exp. (57), e3519, doi:10.3791/3519 (2011).

View Video