Un test de fréquence pour mesurer la cinétique de l'adhérence d'interaction récepteur-ligand, lorsque les deux molécules sont ancrées sur les surfaces des cellules en interaction est décrite. Ce test mécanique à base est illustrée à l'aide d'une micropipette pressurisés cellules rouges du sang humain en tant que capteur d'adhérence et de l'intégrine αLβ2 et de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 que l'interaction des récepteurs et des ligands.
Le test d'adhérence micropipette a été développé en 1998 pour mesurer deux dimensions (2D) récepteur-ligand cinétique de liaison 1. L'essai utilise un globule rouge humain (RBC) en tant que capteur d'adhérence et de cellules présentant l'une des molécules en interaction. Elle emploie micromanipulation pour amener le RBC en contact avec une autre cellule qui exprime la molécule interagissant avec d'autres zone contrôlée avec précision et le temps pour permettre la formation de liaison. L'événement d'adhérence est détecté comme un allongement de RBC sur la tirant les deux cellules à part. En contrôlant la densité des ligands immobilisés sur la surface du globule, la probabilité de l'adhésion est maintenu à la mi-chemin entre 0 et 1. La probabilité d'adhérence est estimée à partir de la fréquence des événements d'adhésion dans une séquence de cycles de contacts répétés entre les deux cellules pour un temps de contact donné. Varier le temps de contact génère une courbe de liaison. Le montage d'un modèle probabiliste pour récepteur-ligand de réaction cinétique de 1 à la liaisoncourbe de revient de l'affinité 2D et hors-taux.
Le test a été validé en utilisant des interactions avec des récepteurs Fcy IgG Fc 1-6, avec des ligands des sélectines glycoconjugués 6-9, les intégrines avec des ligands 10-13, homotypical cadhérine contraignante 14, récepteur des cellules T et des complexes d'histocompatibilité corécepteur peptide-major 15 – 19.
La méthode a été utilisée pour quantifier les règlements de la cinétique 2D par des facteurs biophysiques, comme la membrane microtopology 5, la membrane d'ancrage 2, l'orientation moléculaire et de la longueur 6, 9 raideurs transporteur, la courbure 20 et 20 vigueur impact, ainsi que les facteurs biochimiques, tels que des modulateurs du microenvironnement du cytosquelette et la membrane où les molécules interagissant résident et l'organisation de surface de ces molécules 15,17,19.
La méthode a également été utilisé to Etude de la liaison simultanée de deux espèces récepteur-ligand 3,4, et les interactions trimoléculaire 19 en utilisant un modèle modifié 21.
L'avantage majeur de cette méthode est qu'elle permet l'étude des récepteurs membranaires dans leur environnement natif. Les résultats pourraient être très différents de ceux obtenus en utilisant des récepteurs purifiés 17. Il permet également d'étudier les interactions récepteur-ligand dans un délai inférieur à la seconde avec une résolution temporelle bien au-delà des méthodes typiques biochimiques.
Pour illustrer la méthode de fréquence micropipette adhésion, nous montrons mesure cinétique de la molécule d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) fonctionnalisés sur les globules rouges se liant à l'intégrine α L β 2 sur les neutrophiles avec des dimères de la E-sélectine dans la solution pour activer α L β 2.
Pour utiliser avec succès le test de fréquence d'adhérence micropipette on doit considérer plusieurs étapes critiques. Premièrement, assurez-vous d'enregistrer les interactions spécifiques pour le système récepteur-ligand d'intérêt. Mesures de contrôle non spécifiques (cf. Fig. 3, 4) assurer la spécificité. Idéalement, les probabilités d'adhérence non spécifique doit être inférieur à 0,05 pour toutes les durées de contact et d'avoir une différence significative entre les proba…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par des subventions du NIH R01HL091020, R01HL093723, R01AI077343 et R01GM096187.
Name of the reagent | Company | Catalogue # | Comments |
---|---|---|---|
10x PBS | BioWhittaker | 17-517Q |
Dilute to 1x with deionized water prior to use |
Vacutainer EDTA | BD | 366643 | RBCs isolation |
10ML PK100 | |||
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | RBCs isolation |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | EAS-45 preparation |
D-glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | EAS-45 preparation |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich | 6360 | EAS-45 preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | EAS-45 preparation |
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄) | Fisher Scientific | S374 | EAS-45 preparation |
L-glutamine | Sigma-Aldrich | G5763 | EAS-45 preparation |
Biotin-X-NHS | Calbiochem | 203188 | RBCs biotinylation |
Dimethylformamide (DMF) | Thermo Scientific | 20673 | RBCs biotinylation |
Borate Buffer (0.1M) | Electron Microscopy Sciences | 11455-90 | RBCs biotinylation |
Streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | Ligand functionalizing |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow cytometer | BD Immunocytometry Systems | BD LSR II |
Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" |
Kimble Glass Inc. | 46485-1 | Micropipette pulling |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
PE α-human CD11a Clone HI 111 |
eBioscience | 12-0119-71 | Reagent for Fig.1 |
PE anti-human CD54 | eBioscience | 12-0549 | Reagent for Fig.1 |
Mouse IgG1 Isotype Control PE | eBioscience | 12-4714 | Reagent for Fig.1 |
hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-303 | Micropipette system |
Mechanical manipulator | Newport | 461-xyz-m, SM-13, DM-13 | Micropipette system |
piezoelectric translator | Physik Instrumente | P-840 | Micropipette system |
LabVIEW | National Instruments | Version 8.6 | Micropipette system |
DAQ board | National Instruments | USB-6008 | Micropipette system |
Optical table | Kinetics Systems | 5200 Series | Micropipette system |