Heft frekvens analyse for In Situ Kinetics Analyse av Cross-junctional molekylære interaksjoner på Cell-Cell Interface

Summary

En vedheft frekvens assay for måling av reseptor-ligand interaksjoner kinetikk når begge molekyler er forankret på overflater av vekselvirkende cellene er beskrevet. Denne mekanisk-baserte analysen er eksemplifisert ved hjelp av en mikropipette-trykksatt human røde blodceller som vedheft sensor og integrin αLβ2 og intercellulær adhesjonsmolekyl-1 som samspill reseptorer og ligander.

Abstract

Den mikropipette vedheft analysen ble utviklet i 1998 for å måle to-dimensjonale (2D) reseptor-ligand binding kinetikk ^1. Analysen bruker en menneskelig røde blodlegemer (RBC) som vedheft sensor og presentere celle for en av de vekselvirkende molekyler. Det sysselsetter mikromanipulasjonsprosedyre å bringe RBC i kontakt med en annen celle som uttrykker den andre samspill molekylet med presist kontrollert område og tid for å muliggjøre bindingen formasjon. Vedheft hendelse er oppdaget som RBC forlengelse på å trekke de to cellene fra hverandre. Ved å kontrollere tettheten av ligander immobilisert på RBC overflaten, er sannsynligheten for vedheft holdt i mid-range mellom 0 og 1. Vedheft Sannsynligheten er beregnet fra hyppigheten av vedheft hendelser i en sekvens av gjentatt kontakt sykluser mellom de to cellene for en gitt kontakt tid. Varierende kontakten tiden genererer en bindende kurve. Fitting en sannsynlighets modell for reseptor-ligand reaksjonskinetikk ¹ til bindendekurve returnerer 2D affinitet og off-rate.

Analysen har blitt validert ved hjelp av interaksjoner av Fcγ reseptorer med IgG ^1-6 Fc, selectins med glycoconjugate ligander ^6-9, integriner med ligander ^10-13, homotypical cadherin ¹⁴ binding, T-celle reseptor og coreceptor med peptid-dur histocompatibility komplekser ^{15 – 19.}

Metoden har vært brukt til å kvantifisere reguleringer av 2D kinetikk ved biofysiske faktorer, som membranen microtopology ^5, membran anker ^2, molekylær orientering og ⁶ lengde, carrier stivhet ^9, kurvatur ^20, og impingement force ^20, samt biokjemiske faktorer, slik som modulatorer av cytoskjelettet og membran mikromiljøet hvor samspill molekyler bor og overflaten organiseringen av disse molekylene ^15,17,19.

Metoden har også blitt brukt to studere samtidig binding av dual reseptor-ligand arter ^3,4, og trimolecular interaksjoner ¹⁹ ved hjelp av en modifisert modell ^21.

Den store fordelen med metoden er at det tillater studier av reseptorer i sitt eget membran miljø. Resultatene kan være svært forskjellig fra de som ble oppnådd ved hjelp av renset reseptorer ^17. Den tillater også studier av reseptor-ligand interaksjoner i en sub-sekunders tidsskala med temporal oppløsning langt utover typiske biokjemiske metoder.

For å illustrere mikropipette vedheft frekvens metoden, viser vi kinetikk måling av intercellulær adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1) functionalized på RBCs binding til integrin α _L β ₂ på nøytrofile med dimeric E-selektin i løsningen for å aktivere α _L β _2.

Protocol

1. RBCs isolasjon fra fullblod Forbered EAS-45 løsninger. Vei opp alle ingredienser fra tabell I og oppløses i 100-200ml av DI vann. Tilsett vann til å gjøre 1000ml løsning og juster pH til 8,0. Filter og delmengde av 50ml. Fryses ved -20 ° C for lagring. Merk: Step 1.2 skal utføres av en utdannet medisinsk faglig som for eksempel en sykepleier, med en Institutional Review Board godkjent protokollen. Tegn 3-5ml av blod fra media…

Discussion

For å kunne bruke mikropipette vedheft frekvens analysen bør man vurdere flere kritiske trinn. Først, sørg for å registrere spesifikke interaksjonsstudier for reseptor-ligand system av interesse. Uspesifikke kontroll målinger (jf. fig. 3, 4) sikre spesifisitet. Ideelt sett bør uspesifikk adhesjon sannsynligheter være under 0,05 for all kontakt tid varigheter og å ha en signifikant forskjell mellom de spesifikke og uspesifikke vedheft sannsynligheter for hvert tidspunkt. Ulike metoder kan brukes til å feste lig…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue #	Comments
10x PBS	BioWhittaker	17-517Q	Dilute to 1x with deionized water prior to use
Vacutainer EDTA	BD	366643	RBCs isolation
10ML PK100
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	RBCs isolation
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	EAS-45 preparation
D-glucose (dextrose)	Sigma-Aldrich	G7528	EAS-45 preparation
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	6360	EAS-45 preparation
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	EAS-45 preparation
Sodium Phosphate, Dibasic (Na₂HPO₄)	Fisher Scientific	S374	EAS-45 preparation
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G5763	EAS-45 preparation
Biotin-X-NHS	Calbiochem	203188	RBCs biotinylation
Dimethylformamide (DMF)	Thermo Scientific	20673	RBCs biotinylation
Borate Buffer (0.1M)	Electron Microscopy Sciences	11455-90	RBCs biotinylation
Streptavidin	Thermo Scientific	21125	Ligand functionalizing
BSA	Sigma-Aldrich	A0336	Ligand functionalizing
Quantibrite PE Beads	BD Biosciences	340495	Density quantification
Flow cytometer	BD Immunocytometry Systems	BD LSR II	Density quantification
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30"	Kimble Glass Inc.	46485-1	Micropipette pulling
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP2629-1	Chamber assembly
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-G	Chamber assembly
PE α-human CD11a Clone HI 111	eBioscience	12-0119-71	Reagent for Fig.1
PE anti-human CD54	eBioscience	12-0549	Reagent for Fig.1
Mouse IgG1 Isotype Control PE	eBioscience	12-4714	Reagent for Fig.1
hydraulic micromanipulator	Narishige	MO-303	Micropipette system
Mechanical manipulator	Newport	461-xyz-m, SM-13, DM-13	Micropipette system
piezoelectric translator	Physik Instrumente	P-840	Micropipette system
LabVIEW	National Instruments	Version 8.6	Micropipette system
DAQ board	National Instruments	USB-6008	Micropipette system
Optical table	Kinetics Systems	5200 Series	Micropipette system