Моделирование и обработка изображений 3-мерная коллективной Вторжение сотовый
Summary
Модели инвазии опухоли клетки в трехмерном внеклеточного матрикса лучше отражать<em> В естественных условиях</em> Ситуацию, чем двумерные анализов подвижности. Использование матрицы вторжения тестов в сочетании с конфокальной микроскопии флуоресцентно-меченых клеток, подробную информацию о вторжении режимы и конкретный вклад ведущих против следующих клетки могут быть получены.
Abstract
Определяющей характеристикой рака злокачественности инвазии и метастазирования 1. В некоторых видов рака (д г. Глиомы 2), местной инвазии в окружающие здоровые ткани является основной причиной болезни и смерти. Для других видов рака (д г. Молочной железы, легких и т.д..), То процесс метастазирования, в котором клетки опухоли перейти от основной массы опухоли, колонизировать дистальных участках и в конечном счете способствовать отказу органов, которые в конечном итоге приводит к заболеваемости и смертности 3. Было подсчитано, что инвазии и метастазирования несут ответственность за 90% смертей от рака 4. В результате, наблюдается повышенный интерес в выявлении молекулярных процессов и критических посредников белка инвазии и метастазирования в целях улучшения диагностики и лечения 5.
Задача ученых рака является развитие вторжения анализов, которые достаточно похожи в естественных условиях ситуациячтобы точного моделирования болезни 6. Двумерные анализов клеточной подвижности носят информативный об одном аспекте вторжения и не принимают во внимание внеклеточного матрикса (ECM), белка ремоделирования, который также является важным элементом. В последнее время исследования изысканные наше понимание опухолевой инвазии клеток и показали, что отдельные клетки могут перемещаться по удлиненные или округлые режимах 7. Кроме того, было оценить ее вклад коллективного вторжения, при котором клетки вторгнуться в нити, листы и кластеры, особенно в наиболее дифференцированных опухолей, которые поддерживают эпителиальных характеристики, распространение рака 8.
Мы представляем более совершенный метод 9 для изучения вклада кандидата белков коллективного вторжения 10. В частности, на основе технического отдельные пулы клеток, чтобы выразить различные флуоресцентные белки, можно молекулярно анализировать деятельность и Протейнс требуется в ведущих клетки против тех, которые требуются в следующих клеток. Использование РНК-интерференции обеспечивает молекулярный инструмент для экспериментально разбирать процессы, связанные с отдельными вторжения клеток, а также в различных положениях коллективного вторжения. В этой процедуре, смеси флуоресцентно-меченых клеток высевали на нижней части вставки Transwell ранее заполненную белка Матригель ECM, то разрешено вторгаться "вверх" через фильтр и в Матригель. Реконструкция Z-серии изображений стеки, полученные конфокальной микроскопии, в трехмерных представлений позволяет для визуализации коллективно вторжения пряди и анализ представления флуоресцентно-меченых клеток в сравнении с ведущими следующие позиции.
Protocol
Discussion
Анализы Матригель вторжения традиционно были созданы с клетками помещали на слой внеклеточных белков матрицей с хемоаттрактант вызванных моторики навстречу и через фильтр, в нижней части. Инвазивности был забит как функция, сколько ячеек можно было пересчитать по нижней стороне филь…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование данного исследования от исследований рака Великобритании.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) | GIBCO | 21969 |
| Fetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140 |
| 200 mM L-Glutamine (100x) | GIBCO | 25050-032 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO | 25300 |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | AL-118 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| 6.5mm Transwells, 8.0 µm pore size | Corning | 3422 |
| Complete Matrigel | BD Biosciences | 354234 |
| Calcein AM | Invitrogen | C1430 |
| RNase | Qiagen | 19101 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Confocal microcope | Leica | SP2MP |
References
- Olson, M. F., Sahai, E. The actin cytoskeleton in cancer cell motility. Clin. Exp. Metastasis. 26, 273-287 (2008).
- Hoelzinger, D. B., Demuth, T., Berens, M. E. Autocrine factors that sustain glioma invasion and paracrine biology in the brain microenvironment. J. Natl. Cancer. Inst. 99, 1583-1593 (2007).
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, 1559-1564 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The Hallmarks of Cancer. Cell. 100, 57-70 (2000).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods. Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Croft, D. R., Olson, M. F. Regulating the conversion between rounded and elongated modes of cancer cell movement. Cancer Cell. 14, 349-351 (2008).
- Wolf, K. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nat. Cell. Biol. 9, 893-904 (2007).
- Hennigan, R. F., Hawker, K. L., Ozanne, B. W. Fos-transformation activates genes associated with invasion. Oncogene. 9, 3591-3600 (1994).
- Scott, R. W. LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells. J. Cell. Biol. 191, 169-185 (2010).
