Summary
القوات الميكانيكية تلعب دورا أساسيا في نمو الرئة وإصابة الرئة. هنا، نحن تصف وسيلة لعزل القوارض نوع رئة الجنين الخلايا الظهارية الثاني والخلايا الليفية، ويعرضهم لتحفيز الميكانيكية باستخدام
Abstract
القوات الميكانيكية ولدت في الرحم بواسطة حركات التنفس تشبه المتكررة وانتفاخ سائل بالغة الأهمية بالنسبة لتنمية رئة طبيعية. ومن المكونات الرئيسية للتنمية الرئة هو نوع من التمايز خلايا سنخية الثاني الظهارية، المصدر الرئيسي للتوتر السطحي الرئوي. هذه الخلايا أيضا المشاركة في توازن السوائل في التجويف السنخي، دفاع المضيف، وإصلاح الضرر. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن خلايا الرئة البعيدة حمة يتعرض مباشرة لتمتد مبالغ فيه خلال التهوية الميكانيكية بعد الولادة. ومع ذلك، لا أن الآليات الدقيقة الجزيئية والخلوية من قبل خلايا الرئة التي تستشعر المحفزات الميكانيكية للتأثير على نمو الرئة وتعزيز إصابة الرئة مفهومة تماما. هنا، ونحن نقدم طريقة بسيطة ونقاء عالية لعزل نوع الخلايا الليفية والثاني من الرئتين القوارض الجنين. ثم، ونحن تصف في نظام المختبر، وحدة الانفعال فليكسسيل، لتوفير التحفيز الميكانيكي للخلايا الجنين، ومحاكاة القوات الميكانيكية فيتكون الجنين الرئة أو إصابة الرئة. هذا النظام التجريبي يوفر أداة ممتازة لتحقيق الآليات الجزيئية والخلوية في خلايا الرئة الجنين عرضة للتمدد. باستخدام هذا النهج، وقد حددت مختبرنا مستقبلات عدة والبروتينات مما يشير إلى أن المشاركة في mechanotransduction في تطوير رئة الجنين وإصابة الرئة.
Protocol
1. طلاء لوحات مع بروتينات ECM
- تحت ظروف معقمة، مزيج 120 ميكروغرام من laminin مع 12 مل من البرد PBS 1X معقم لكل لوحة.
- أخذ لوحات غير المعالجة Bioflex وإضافة 2ml من حل كل بئر (تركيز النهائي من laminin هو 2 ميكروغرام / سم 2). بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم غيرها من البروتينات ECM، مثل 1-الكولاجين [10 ميكروغرام / سم 2]، فبرونيكتين [5 ميكروغرام / سم 2]، vitronectin [0.5 ميكروغرام / سم 2] أو الإيلاستين [10 ميكروغرام / سم 2]. تقنية الطلاء هو على غرار ما هو وصفها لطلاء laminin. تأكد من أن يتم تغطيتها بالكامل من الآبار بواسطة الحل.
- التفاف على لوحات من البلاستيك ووضعها في 4 درجات مئوية على سطح مستو بين عشية وضحاها للسماح للlaminin ما تمتز في الجزء السفلي من الآبار. في ظل هذه الظروف، يمكن تخزين لوحات لمدة اسبوع على الاقل في حين لا يزال الإبقاء على وظيفة جيدة ECM.
- اليوم التالي، تحت ظروف معقمة، وغسل 3 مرات الآبار مع PBS 1X.
- شطف لوحات 3 مرات مع PBS 1X لإزالة البروتينات unadsorbed.
- الحفاظ على لوحات عند 37 درجة مئوية في DMEM حتى يتم عزل الخلايا من الخطوة 2،14.
2. عزلة من نوع الجنين القوارض الرئة الخلايا الظهارية الثاني
قبل يوم من العزلة لديهم كؤوس مع شاشة مختلفة تنسجم النايلون حجم مشبع وجاهز.
- الحصول على الرئتين الجنين من توقيت الحوامل فأر / جرذ في 19-E17 من الحمل. نقل الأنسجة في أنبوب 50 مل مخروطي يحتوي على DMEM المتوسطة ووضعه على الجليد.
- جعل العازلة الهضم في أنبوب 50 مل مخروطي الشكل: (10 مل). لهذا الحجم، ويتم استخدام أنسجة الرئة من حوالي 20 أجنة من الماوس / جرذ.
8.5 مل DMEM
0.5 مل 500mM درجة الحموضة 7.4 HEPES
5 ملغ كولاجيناز 1
5 ملغ كولاجيناز 1A
1 مل الدجاج مصل الدم، حرارة المعطل - تخلط جيدا حتى تذوب جميع المكونات ومرشح من خلال مرشح ميكرون 0.2 حقنة داخل غطاء محرك السيارة عقيمة. وضع أنبوب مخروطي يحتوي على الهضم العازلة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- إزالة المتوسطة DMEM من أنبوب مخروطي الشكل من الخطوة 2.1 ونقل الأنسجة في طبق بتري معقمة.
- فرم الرئتين بشكل جيد مع مقص معقم أو شفرة حلاقة لجعل قطعة نسيج أقل من 1 ملم ونقل الأنسجة في أنبوب مخروطي يحتوي على الهضم العازلة قبل حرارة من الخطوة 2.3.
- هضم الأنسجة بواسطة pipetting صعودا وهبوطا:
100 مرة مع ماصة 10 مل
100 مرة مع ماصة 5 مل
100 مرة مع ماصة باستير - أجهزة الطرد المركزي لجناسة في 1300 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة بعناية وطاف بواسطة طموح وإعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على خلايا في 15 مل من DMEM FBS زائد 20٪.
- إخراج أكواب شاشة مع 100 -، 30 - وتنسجم النايلون 15 ميكرون وال مكانأكان على العقيمة الأكواب ML 150.
- إضافة جناسة الخلية من الخطوة 2.8 وتصفية بالتتابع من خلال 100 -، 30 -، و 15 ميكرون الكؤوس شاشة شبكة.
- جمع تجمعت غير مفلتر الخلايا من 30 - وتنسجم 15 ميكرون بعد عدة غسلات مع DMEM زائد FBS 10٪ لتسهيل الترشيح من غير طلائي الخلايا.
- رفض الترشيح من شبكة من 15 ميكرون والتي في معظمها يحتوي على الخلايا الليفية.
- تنقية مزيد من نوع الخلايا التي تفرخ خلايا الثاني من الخطوة 2،11 في 75 سم 2 قوارير لمدة 30 دقيقة (approximatelly10 مل من تعليق خلية في قارورة).
- جمع وطاف والطرد المركزي في 1300 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
- إزالة بعناية وطاف بواسطة طموح وإعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على الخلايا في مصل الدم خالية من DMEM. حجم إعادة تعليق يعتمد على كمية من النسيج المصنعة. تقريبا، ونحن لوحة ما يعادل الخلايا التي تم الحصول عليها من جنين واحد في كل بئر (2 مل) من أجل عشيعشية بين 60-70٪ confluency في اليوم التالي.
- لوحة الخلية تعليق على لوحات لمدة ستة جيدا Bioflex precoated مع laminin أو فبرونيكتين.
3. عزل الخلايا الليفية الجنين الرئة القوارض
- اتبع نفس الخطوات المذكورة أعلاه لعزل نوع الخلايا الثاني يصل الى 2.11.
- أخذ الترشيح من شبكة من 15 ميكرون (بدون غسل السابقة؛ حجم تقريبي هو 10-15 مل)، وطبق على CM-75 2 في 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة للسماح للالليفية الالتزام.
- نضح في supernantant واستبدالها مع المصل خالية DMEM واحتضان بين عشية وضحاها.
- اليوم التالي، وحصاد الخلايا مع 0.25٪ (وزن / المجلد) التربسين في EDTA ملي 0.4 و لوحة منهم على لوحات Bioflex precoated مع فبرونيكتين.
4. تجريبي نظام لتوفير التحفيز الميكانيكي للخلايا الرئة
- بذور الخلايا (حوالي 50٪ متموجة) على لوحات ثقافة Bioflex في مصل الدم خالية من DMEM (2 مل / جيد) والسماح لهم تعلق وspreإعلان لمدة لا تقل 6H قبل التجارب. في عام مختبرنا يحافظ على خلايا في ثقافة لحوالي 24H قبل تطبيق إجهاد ميكانيكي. إذا كانت هناك حاجة لعدد محدد من الخلايا للتجارب، بعد العزلة، وتتم المحافظة على نوع الخلايا الثاني في مصل الدم خالية من DMEM 75 سم 2 والقوارير في اليوم التالي، وtrypsinized الخلايا، وعدها والمصنف ثم.
- تقام اليوم التالي، ويتم استبدال وسائل الاعلام مع DMEM المصل خالية من جديد (2 مل / جيد) وألواح bioflex في وحدة FX-5000 فليكسسيل الانفعال. وينبغي أن يكون هناك Monolayers أكبر من 80٪ متموجة قبل بدء التجارب.
- يتم تطبيق الضغط Equibiaxial إلى الأغشية. في نظام من سلالة تختلف تبعا للمحاكاة من القوات الميكانيكية في الجسم الحي (انظر المناقشة).
- وتستخدم الخلايا المزروعة في غير امتدت الأغشية تربيتها بشكل متواز والضوابط.
- في نهاية هذه التجارب، يمكن معالجة monolayers لتحليل التغيرات في التعبير الجيني (على سبيل المثال السطحي البروتين C)من وفرة البروتين في الوقت الحقيقي PCR، من قبل لطخة غربية، وما إلى ذلك أيضا، يمكن أن تكون ثابتة monolayers للتجارب كيمياء سيتولوجية مناعية. لهذه التقنية، وبعد التثبيت، يتم قطع الأغشية silastic الخروج من لوحات والتي شنت على الشرائح الزجاجية باستخدام 10-20 ميكروليتر من الماء كعامل المتصاعدة قبل permeabilization وحضانة مع الأجسام المضادة. ويمكن أيضا أن تستخدم طاف للتحقيق في وجود عوامل النمو، السيتوكينات، الخ.
5. ممثل النتائج
عزل الرقم 1 والرقم 2 مرحلة ممثل المعرض على النقيض من الصور الفوتوغرافية للE18 جنين فأر نوع الخلايا الثاني باستخدام تقنية الموصوفة في هذه المخطوطة.
الشكل (3) يدل على أن السلالة الميكانيكية يدفع تمايز الخلايا الجنينية النوع الثاني الظهارية باستخدام بروتين بالسطح-C كعلامة.
الشكل 1. معدلresentative المرحلة على النقيض من الصورة التي اتخذت مباشرة بعد العزلة التي تبين ظهور تجمعت من نوع الخلايا الجنينية الثاني.
تم عزل الشكل 2. E18 الجنين نوع الخلايا الظهارية الثاني كما هو موضح هنا ومطلية على لوحات bioflex المغلفة مع laminin. لقد التقطت الصورة في اليوم التالي بعد وثبتت عدم امتدت الخلايا في امتصاص العرق. كان مصمما على نقاء هذه الخلايا لتكون 90 ± 5٪ عن طريق التحليل المجهري للمورفولوجيا الخلايا الظهارية والمناعية لSP-C.
تعرضت الشكل 3. نوع الجنين الخلايا الظهارية الثاني لدوري سلالة 5٪ في 40 دورة / دقيقة ل16H. وصمة عار) الشمالية من بروتين بالسطح C (SP-C) التعبير مرنا تظهر ان السلالة يدفع نوع تمايز الخلايا الثاني باستخدام مختلف ركائز ECM . + / - علامات تمثل التعرض أو عدم قتدريب، على التوالي. وتعرض البيانات كما يعني + / - ووزارة شؤون المرأة، ن = 3؛ * P <0.05 B) وصور كيمياء سيتولوجية مناعية الإسفار يتظاهرون مستويات البروتين SP-C (الخضراء) في خلايا الجنين نوع الثاني المكشوفة أو لا (الرقابة) إلى سلالة الميكانيكية. كانت counterstained نوى مع دابي (الأزرق). بار، و 10 ميكرون. ج) نتائج طخة غربية من ثلاث تجارب أظهرت أن تمتد الميكانيكية يزيد SP-C بروتين. N = 3؛ * P <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا المخطوط، وصفنا وسيلة لعزل الخلايا الجنينية النوع الثاني الطلائية والخلايا الليفية، ويعرضهم لتحفيز الميكانيكية باستخدام جهاز الانفعال فليكسسيل. وقد استخدمنا هذه التقنية لتقييم تمايز الخلايا الظهارية 1،2 و لدراسة مستقبل ومسارات إشارات تفعيلها من خلال امتداد 3-9. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق استجابات الخلية الناجمة عن الاصابة الميكانيكية 10،11. ويستند هذا الإجراء على الهضم في أنسجة الرئة مع كولاجيناز. فإنه يستفيد من ميل من الخلايا من النوع الثاني لتتجمع معا بعد الهضم. خطوات مهمة أثناء أداء هذه التقنية هي تنميق النسيج جيدا لتسهيل عملية الهضم من الرئة وغسل بدقة في الخلايا غير مفلتر على تنسجم ميكرون 30 و 15 إلى تسهيل ترشيح من الخلايا الظهارية غير، وبالتالي لتحقيق مزيد من نقاء من الخلايا من النوع الثاني .
مختبرنا يستخدم مembranes المغلفة مع الكولاجين أو laminin لمحاكاة تكوين ECM الأغشية الطابق السفلي. ومع ذلك، عندما تتعرض الخلايا لاستطالة 20٪، قد فصل الخلايا من خلال الركيزة تمتد وينبغي النظر فيها باعتبارها الركيزة فبرونيكتين بديل.
وهناك اعتبار آخر مهم هو تجنب التقاء 100٪ من monolayers الخلية قبل أن تمتد، نظرا إلى أن هذا قد يشجع خلية الى خلية الاتصال بدلا من اتصال الخلية إلى مصفوفة الخلايا، وبالتالي قد لا "معنى" النسبة المئوية للاستطالة التي أقامتها البروتوكول.
وحدة الانفعال فليكسسيل يستخدم الفراغ لتشويه ثقافة مرنة أسفل لوحة. تطبيق فراغ تمتد كل غشاء على آخر الاسطوانة المركزية، وخلق موحدة سلالة شعاعي وكفافي عبر سطح الغشاء وبالتالي توفير انتفاخ equibiaxial، مشابهة لظروف في الجسم الحي (انظر الرسوم المتحركة، والفيديو نظرة عامة التخطيطي، مع إذن، والدكتور جعفر بانيس فليكسخلية المؤسسة الدولية، www.flexcellint.com). ويوفر هذا النظام، التي تسيطر عليها تشوه تعريف ثابت أو دوري من قبل نظام سلالة معينة. لتقليد حركات التنفس الجنين يتم تطبيق نظام دوري تمتد وتمتد ما بين 2،5-5٪ في 40-60 دورة / دقيقة. لم يكن هناك اتفاق على نسبة استطالة تستشعر رئة الجنين أثناء التنفس الجنين. بعض الكتاب يعتقدون أن انتفاخ 5٪ هو 12 مناسبة في حين أن باحثين آخرين يرون أن 2.5٪ هي أكثر تمثيلا للفي ظروف فيفو 13،14. لمحاكاة الضغط المستمر انتفاخ، يستخدم 2.5٪ بروتوكول امتداد مستمر. ويستخدم لمحاكاة إصابات الرئة، وتمتد دوري 20٪ في 40 دورة / دقيقة. القيود المحتملة لهذه التقنية تتضمن زيادة تشوه خلايا المصنف في مجال الغشاء الطرفية إلى آخر التحميل. ومن أوجه القصور هو عدم القدرة على توفير استطالة أكبر من 15-20٪ إذا تم استخدام معدل دورة عالية (أكثر من 40 دورة / دقيقة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
