Summary
機械的な力は、肺の開発と肺傷害において重要な役割を果たしています。ここでは、げっ歯類の胎児の肺II型上皮細胞と線維芽細胞を分離するとを使用して機械的刺激にそれらを公開する方法について説明します。
Abstract
反復的な呼吸のような動きによって、流体の膨張によって子宮内で生成された機械的な力は、通常の肺の開発のために重要である。肺開発の主要なコンポーネントは、肺サーファクタントの主要な源、肺胞II型上皮細胞の分化である。これらの細胞はまた、肺胞腔、宿主防御、および損傷修復に体液の恒常性に参加しています。さらに、遠位の肺実質細胞が直接、出生後の機械的人工換気中の誇張されたストレッチを公開することができます。しかし、肺の細胞が肺の開発に影響を与えると肺傷害を促進するために機械的刺激を感知する正確な分子·細胞メカニズムは完全に理解されていません。ここでは、げっ歯類の胎児の肺からのII型細胞と線維芽細胞を単離するためのシンプルかつ高純度のメソッドを提供します。その後、我々は、機械的な力をシミュレートし、胎児の細胞に機械的な刺激を提供するためには、in vitroシステム、Flexcellひずみユニットで説明胎児肺の開発や肺損傷。この実験システムでは、ストレッチにさらされる胎児肺細胞では分子·細胞メカニズムを調べるための優れたツールを提供しています。このアプローチを使用して、私たちの研究室では、胎児の肺の開発と肺傷害にメカノに参加し、いくつかの受容体とシグナル伝達タンパク質を同定しました。
Protocol
1。 ECMタンパク質とプレートのコーティング
- 無菌条件下で、プレート当たり冷滅菌1X PBS 12 mlでラミニン120μgを混合します。
- Bioflex未処理の板を取り、各ウェルに溶液の2ミリリットルを追加します（ラミニンの最終濃度は2μg/ cm 2である）。また、他のECMタンパク質は、コラーゲン-1 [10μgの/ cm 2]と、フィブロネクチン[を5μg/ cm 2]と、ビトロネクチン[0.5μgの個/ cm 2]またはエラスチン[10μgの個/ cm 2]のように、使用することができます。コーティング技術は、それがラミニンコーティングのために説明されているものに似ています。井戸は完全に溶液で覆われていることを確認してください。
- プラスチック製のプレートをラップし、ウェルの底に吸着ラミニンを可能にするために一晩、平らな面に4℃で置く。まだ良いECMの機能を維持しながら、これらの条件において、プレートは少なくとも1週間保存することができます。
- 翌日、無菌条件下で、1X PBSでウェルを3回洗浄します。
- 非吸着タンパク質を除去するために1X PBSでプレートを3回すすいでください。
- 細胞は、ステップ2.14から隔離されるまで37℃DMEM中℃でプレートを保持します。
2。胎児の齧歯類の肺II型上皮細胞の分離
分離前の日は、オートクレーブと準備ができて、異なるサイズのナイロンメッシュを使用して、画面のコップを持っています。
- 妊娠のE17-19の上でマウス/ラット時限妊婦から胎児肺を取得します。 DMEM培地を含む50 mlのコニカルチューブに組織を移し、氷の上に置きます。
- 50 mlコニカルチューブに消化バッファーを作成します。（10ミリリットル）。このボリュームには、マウス/ラットから約20胎児からの肺組織が使用されます。
8.5ミリリットルDMEM
0.5ミリリットル500MM pH7.4のHEPES
5 mgのコラゲナーゼ1
5 mgのコラゲナーゼ1A
1ミリリットル鶏血清、不活化熱 - すべてのコンポーネントが、無菌フード内0.2ミクロンのシリンジフィルターを通して溶解し、フィルターされるまでよく混ぜる。 37℃の水浴中で消化緩衝液を含むコニカルチューブ℃を置く
- ステップ2.1からコニカルチューブからDMEM培地を除去し、滅菌シャーレに組織を転送します。
- 1mm以上の組織片は、以下のように、ステップ2.3から予め温めておいた消化緩衝液を含むコニカルチューブに組織を転送するために滅菌済みのハサミかカミソリの刃でも肺をミンチ。
- 上下にピペッティングによって組織を消化する。
10ミリリットルピペットで100倍
5ミリリットルピペットで100倍
パスツールピペットで100倍 - 室温で5分間1300 rpmでホモジネートを遠心分離します。
- 慎重に吸引して上清を除去し、ペレットをDMEMを15ml加え、20％FBSで細胞を含む再懸濁する。
- 100画面のコップを取り出し、 - 、30 - 、15ミクロンのナイロンメッシュと場所番目滅菌した150mlのビーカーにEM。
- ステップ2.8から細胞ホモジネートを追加し、順次フィルタ100を介して - 、30 - 、15ミクロンのメッシュスクリーンカップ。
- 非上皮細胞のろ過を容易にするために、DMEM +10％FBSで数回洗浄した後、15ミクロンメッシュ - 凝集30から非濾過し、細胞を収集します。
- 主に線維芽細胞が含まれている15ミクロンメッシュからろ液を捨てる。
- 30分（フラスコ当たりの細胞懸濁液のapproximatelly10 ml）を75-cm 2のフラスコにステップ2.11から細胞をインキュベートすることにより、さらにII型細胞を精製する。
- ペレット細胞に室温で5分間1300 rpmで遠心し上清を収集します。
- 慎重に吸引して上清を除去し、ペレットを無血清DMEM中で細胞を含む再懸濁する。再懸濁の量は、処理された組織の量に依存します。およそ、私たちプレートは、細胞と同等の阿智のために（2 ml）を各ウェルに1つの胎児から得られた次の日にコンフルエントに百分の60から70の間で前夜。
- ラミニンまたはフィブロネクチンでプレコートBioflex 6ウェルプレート上にプレートの細胞懸濁液。
3。胎児のげっ歯類の肺線維芽細胞の分離
- 2.11までのII型細胞の単離のために上記と同じ手順に従ってください。
- 線維芽細胞が付着できるようにするために30〜60分間37℃で75-cm 2の上に、プレートを、15ミクロンメッシュ（おおよその体積は10〜15 mlで前洗浄せず）からのろ液を取る。
- supernantantを吸引除去し、無血清DMEMと交換して、一晩インキュベートする。
- 次の日、0.4mMのEDTAおよびプレートそれらのフィブロネクチンでプレコートBioflexプレート上で0.25％（wt / vol）のトリプシンで細胞を収穫します。
4。肺細胞に機械的刺激を提供するための実験系
- 種子無血清DMEMでBioflex培養プレート上で細胞（約50％コンフルエント）（2ミリリットル/ウェル）し、それらを添付してSPREう実験前少なくとも6時間の広告。一般的に私たちの研究室では、機械的歪みを適用する前に、約24時間の培養中の細胞を維持しています。特定のセルの数は実験に必要な場合は、分離した後、II型細胞は無血清DMEM 75-cm 2のフラスコと次の日に保持され、細胞をトリプシン処理し、計数し、その後に播種されています。
- 翌日、メディアは新鮮な無血清DMEM（2ミリリットル/ウェル）とbioflexプレートに置き換えられますがFlexcell FX-5000ひずみユニットに搭載されている。単分子膜は、実験の開始前に超えない80％コンフルエントでなければなりません。
- 等二軸ひずみが膜に適用されます。株のレジメンは（説明を参照してください）in vivoでの機械的な力のシミュレーションによって異なります。
- 並列で培養した無延伸膜上に培養した細胞を対照として使用されています。
- 実験の終わりに、単分子膜は、遺伝子発現の変更（例えば、界面活性プロテインCのために）分析するために処理することができますリアルタイム-PCR、ウエスタンブロット法によるタンパク質の豊富さなどによっても、組織化単分子膜は、免疫細胞化学実験のために固定することができます。この手法では、固定した後、シラスティック膜は板から切り出しており、抗体を用いた透過性とインキュベーションの前に取り付け剤としての水の10〜20μlを用いてスライドガラス上にマウントされている。上清はまた、成長因子、サイトカインなどの存在を調査するために使用することができます
5。代表的な結果
E18胎児マウスのII型細胞の図1と図2には、show代表的な位相コントラストの写真は、この原稿で説明する手法を用いて単離された。
図3は、その機械的ひずみがマーカーとして界面活性剤、タンパク質-Cを使って胎児のII型上皮細胞の分化を誘導を示しています。
図1。担当者resentative位相コントラストの写真は、右胎児のII型細胞の凝集外観を示す分離後に撮影。
図2：E18胎児のII型上皮細胞は、ここで説明したように単離され、ラミニンでコーティングされたbioflexプレート上に播種した。無延伸細胞はパラホルムアルデヒドで固定した後の写真は、次の日に撮影された。細胞の純度は90であることが決定された±5％をSP-Cの上皮細胞の形態や免疫染色の顕微鏡分析によって。
図3。胎児II型上皮細胞を16時間40サイクル/分で5％、環状の歪みにさらされた。そのひずみを示す界面活性プロテインC（SP-C）mRNAの発現）ノーザンブロットは、異なるECM基板を用いたII型細胞の分化を誘導する。 + / - 記号は、sへの暴露を表すかどうかそれぞれ電車、。データは+ /を意味するとして表示されます- SEM、n = 3で、* P <0.05 B）蛍光免疫細胞化学画像は機械的ひずみにさらされるかどうか（コントロール）胎児のII型細胞でSP-C蛋白質レベル（緑）を実証する。核はDAPI（青）で対比染色した。バーは、そのメカニカルストレッチを示す3つの実験から10μmである。C）ウェスタンブロットの結果は、SP-C蛋白質を向上させます。 N = 3、* P <0.05。
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Discussion
本稿では、我々は胎児のII型上皮細胞と線維芽細胞を分離し、Flexcellひずみ装置を使用して機械的な刺激にそれらを公開する方法について説明します。我々は、上皮細胞の分化1,2を評価し、受容体とストレッチ3月9日によって活性化シグナル伝達経路を研究するためにこのテクニックを使用しています。さらに、このメソッドはまた、機械的損傷10,11によって誘導される細胞の応答を調査するために使用することができます。手順については、コラゲナーゼと肺組織の消化に基づいています。それは消化した後一緒に凝集し、II型細胞の傾向を利用しています。このテクニックを実行中に重要なステップは、肺の消化を促進するためにも組織ミンチであり、非上皮細胞のろ過を容易にするため、II型細胞の高い純度を達成するために、30および15ミクロンのメッシュ上で徹底的に非フィルタ処理細胞を洗浄。
当研究室では、mを使用していますembranesは、基底膜のECM組成をシミュレートするためにコラーゲンやラミニンでコーティングされた。しかし、細胞は20％の伸びにさらされている場合、細胞は伸張時に基板から切り離すことがあり、フィブロネクチンは、代替基質として考慮されるべきである。
別の重要な考慮事項は、これが細胞間の接触ではなく、細胞 - マトリックスの接触を促進する可能性があるため、細胞が "センス"によって設定された伸びの割合はないかもしれないことを考えると、ストレッチする前に細胞単層の100％の合流を避けるためです。プロトコル。
Flexcellひずみユニットはフレキシブルボトム培養プレートを変形させる真空を使用しています。真空のアプリケーションでは、膜表面全体で均一に放射状と円周方向のひずみを作 成し、中央の円柱ポストを介して各膜を伸ばすため、 生体内条件下で （許可を得て、漫画、回路図の概要ビデオを参照してください、博士AJバネスフレックスに似て等二軸膨満を提供するセル·インターナショナル·コーポレーション、www.flexcellint.com）。このシステムは、指定された歪みレジメンによって定義され、制御された静的あるいは周期的変形を提供しています。胎児の呼吸運動を模倣するために40から60サイクル/分で2.5から5パーセントのストレッチの間で周期的なストレッチ療法が適用されます。胎児の呼吸時に胎児の肺の感覚その伸び率についての合意はありません。何人かの著者は他の研究者が2.5％ は 、in vivo の条件13,14 でのより代表的であると主張するのに対し、5％の膨満は、適切な12であると信じています。一定の膨満圧力をシミュレートするために、2.5％の連続ストレッチプロトコルが使用されます。肺損傷を模倣するために、40サイクル/分で20％、環状ストレッチが使用されます。この技術の潜在的な限界は、ロード後に周辺の膜の面積に播種した細胞の変形の増加が含まれています。別の制限は、高サイクルレートが使用されている場合、伸長よりも大きい15から20パーセントを提供することができない（40サイクル/分以上である。）
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
NIHの助成金HD052670でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
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