Et eksperimentelt system til Studieinformationen Mechanotransduction i føtale lungeceller

Summary

Mekaniske kræfter spiller en central rolle i lungeudvikling og lungebeskadigelse. Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af gnaver føtal lunge type II epitelceller og fibroblaster, og at udsætte dem for mekanisk stimulation ved hjælp af en

Abstract

Mekaniske kræfter, der genereres i livmoderen ved gentagne vejrtrækning-lignende bevægelser og af væske udspiling er afgørende for normal lunge udvikling. En nøglekomponent i lungeudvikling er differentieringen af ​​alveolære type II epitelceller, den væsentligste kilde til pulmonal overfladeaktivt middel. Disse celler deltager også i væske homøostase i alveolehulrummet vært forsvar, og skade reparation. Desuden kan den distale lunge parenchymceller blive direkte udsat for overdreven strækning under mekanisk ventilation efter fødslen. Imidlertid er de præcise molekylære og cellulære mekanismer, ved hvilke lungeceller afføler mekaniske stimuli til at påvirke lungeudvikling og fremme lungebeskadigelse ikke fuldstændigt forstået. Her har vi tilvejebringe en enkel og høj renhed fremgangsmåde til isolering af type II-celler og fibroblaster fra gnaver føtale lunger. Derefter beskriver vi en in vitro system, Flexcell Strain enhed til at tilvejebringe mekanisk stimulering fosterceller, som simulerer mekaniske kræfter iføtal lunge udvikling eller lungebeskadigelse. Denne eksperimentelle system giver et fremragende værktøj til at undersøge molekylære og cellulære mekanismer i føtale lungeceller udsat at strække. Anvendelse af denne fremgangsmåde, har vores laboratorium identificeret adskillige receptorer og signalering proteiner, der deltager i mechanotransduction i føtal lunge udvikling og lungebeskadigelse.

Protocol

1. Coating af plader med ECM-proteiner

1. Under sterile betingelser, blandes 120 ug laminin med 12 ml kold steril 1X PBS per plade.
2. Tage Bioflex ubehandlede plader og tilsættes 2 ml af opløsningen til hver brønd (slutkoncentration af laminin er 2 ug / cm ^2). Alternativt kan andre ECM-proteiner kan anvendes, såsom collagen-1 [10 ug / cm ^2], fibronectin [5 ug / cm ^2], vitronectin [0,5 ug / cm ^2] eller elastin [10 ug / cm ^2]. Overtrækket teknik svarer til, hvad det er beskrevet for laminin-coating. Sørge brøndene er helt dækket af opløsningen.
3. Omvikles pladerne med plast og sat ved 4 ° C på en flad overflade natten over for at tillade laminin at adsorbere til bunden af ​​brøndene. Under disse betingelser kan plader opbevares i mindst en uge, medens der stadig bibeholdes god ECM funktion.
4. Næste dag under sterile betingelser, vaskes brøndene 3 gange med 1X PBS.
5. Skylles pladerne 3 gange med 1X PBS for at fjerne adsorberede proteiner.
6. Holde pladerne ved 37 ° C i DMEM, indtil cellerne er isoleret fra trin 2,14.

2. Isolering af føtale gnaver lunge type II epitelceller

Dagen før isolering få skærmen kopper med forskellig størrelse nylon masker autoklaveres og klar.

1. Skaffe føtalt lunger fra tidsindstillet gravide mus / rotte på E17-19 af drægtighedsperioden. Overføres vævet i et 50 ml konisk rør indeholdende DMEM-medium og anbringes på is.
2. Gør fordøjelse buffer i en 50 ml konisk rør (10 ml). Til dette volumen er lungevæv fra cirka 20 fostre fra mus / rotte anvendes.
   8,5 ml DMEM
   0,5 ml 500mM pH 7,4 HEPES
   5 mg Collagenase en
   5 mg Collagenase 1A
   1 ml Chicken serum, varmeinaktiveret
3. Bland godt, indtil alle komponenter er opløst og filtreres gennem et 0,2 mikron sprøjtefilter inde i sterile hætte. Anbring den koniske rør indeholdende fordøjelse buffer i et vandbad ved 37 ° C.
4. Fjerne DMEM medium fra den koniske rør fra trin 2.1 og overføre vævet ind i en steril petriskål.
5. Hakke lungerne og med sterile sakse eller barberblad til at vævsstykker mindre end 1 mm og overføre vævet ind i koniske rør indeholdende det foropvarmede fordøjelse buffer fra trin 2.3.
6. Fordøje vævet ved at pipettere op og ned:
   100 gange med 10 ml pipette
   100 gange med 5 ml pipette
   100 gange med Pasteur-pipette
7. Centrifugeres homogenatet ved 1300 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Forsigtigt supernatanten fjernes ved aspiration og genopslæmmes pelleten indeholdende cellerne i 15 ml DMEM plus 20% FBS.
9. Tag skærmen kopper med 100 -, 30 - og 15-micron nylon masker og sted them på sterile 150 ml bægerglas.
10. Tilføj cellehomogenat fra trin 2,8 og sekventielt filtreres gennem 100 -, 30 - og 15-mikromesh skærmen kopper.
11. Indsamle klumpet ikke-filtreret celler fra 30 - og 15-micron masker efter adskillige ganges vask med DMEM plus 10% FBS for at lette filtrering af ikke-epitelceller.
12. Kassér filtrat fra 15 mikromesh som indeholder det meste fibroblaster.
13. Oprense yderligere type II-celler ved at inkubere celler fra trin 2,11 i 75 ^cm2 kolber i 30 minutter (approximatelly10 ml cellesuspension pr kolbe).
14. Opsamle supernatanten, og der centrifugeres ved 1300 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne.
15. Forsigtigt supernatanten fjernes ved aspiration og genopslæmmes pelleten indeholdende cellerne i serumfrit DMEM. Mængden af ​​resuspension afhænger behandlede mængde væv. Ca vi plade svarende til celler opnået fra en fosteret i hver brønd (2 ml) for at Achieve mellem 60-70% sammenflydning den følgende dag.
16. Pladen cellesuspensionen på Bioflex seks brønds plader coatet med laminin eller fibronectin.

3. Isolering af føtale gnaver lungefibroblaster

1. Følg de samme trin som beskrevet ovenfor for type II celler, isolation op til 2,11.
2. Tage filtrat fra 15 mikromesh (uden forudgående vask omtrentligt volumen 10-15 ml) og pladen på 75 ^cm2 ved 37 ° C i 30-60 minutter for at tillade fibroblaster til at adhærere.
3. Aspirer supernantant og erstatte med serumfrit DMEM og inkuberes natten over.
4. Dagen høste cellerne med 0,25% (vægt / vol) trypsin i 0,4 mM EDTA og pladen dem Bioflex plader belagt med fibronectin.

4. Eksperimentelle system til at tilvejebringe mekanisk stimulering lungeceller

1. Pode celler (ca. 50% konfluente) på Bioflex dyrkningsplader i serumfrit DMEM (2 ml / brønd) og lade dem vedhæfte og SPREannonce i mindst 6 timer før eksperimenter. I almindelighed vores laboratorium opretholder celler i kultur til omkring 24 timer før anvendelse mekanisk belastning. Hvis et bestemt antal celler er påkrævet for de eksperimenter, efter isolering, er type II-celler holdes i serumfrit DMEM ^75-cm2 kolber og næste dag blev celler trypsiniseret, talt og derefter podet.
2. Næste dag, er mediet erstattet med frisk serumfrit DMEM (2 ml / brønd) og Bioflex pladerne er monteret i en Flexcell FX-5000 stamme enhed. Monolag bør ikke være større end 80% sammenflydende før indledningen af ​​forsøgene.
3. Equibiaxial stamme anvendes til membranerne. Regimen af stamme afhænger simulering af mekaniske kræfter in vivo (se diskussionen).
4. Celler dyrket på ikke-strakte membraner dyrket parallelt anvendes som kontroller.
5. Ved afslutningen af ​​forsøgene, kan monolag behandles at analysere ændringer i genekspression (for eksempel overfladeaktive protein C)ved realtid-PCR, protein overflod ved Western blot, etc. Endvidere kan monolag fastsættes for immuncytokemi eksperimenter. For denne teknik, efter fiksering er silastiske membraner udskæres fra pladerne og anbragt på objektglas ved anvendelse af 10-20 ul af vand som en montering middel før permeabilisering og inkubation med antistoffer. Supernatanten kan også anvendes til at undersøge tilstedeværelsen af ​​vækstfaktorer, cytokiner, etc.

5. Repræsentative resultater

Figur 1 og figur 2 viser repræsentative fasekontrast fotografier af E18 føtale muse type II-celler isoleres under anvendelse af teknikken beskrevet i dette skrift.

Figur 3 viser, at mekanisk belastning inducerer differentiering af føtale type II epitelceller med overfladeaktivt protein-C som en markør.

Figur 1. Reppræsentant fasekontrast-fotografi taget lige efter isolering viser klumpet udseende af føtale type II celler.

Figur 2. E18 føtale type II epitelceller blev isoleret som beskrevet her og udpladet på Bioflex plader coatet med laminin. Fotografiet blev taget dagen efter ikke-strakte celler blev fikseret i paraformaldehyd. Renheden af ​​cellerne blev bestemt til at være 90 ± 5% ved mikroskopisk analyse af epitel-celle morfologi og immunfarvning for SP-C.

Figur 3. Føtale type II epitelceller blev udsat for 5% cyklisk belastning på 40 cykler / minut i 16 timer. A) Northern blot af tensidprotein C (SP-C)-mRNA-ekspression viser, at stamme inducerer type II celledifferentiering hjælp af forskellige ECM substrater . + / - Tegn repræsenterer eksponering eller ikke at stræne, hhv. Dataene er præsenteret som gennemsnit + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) fluorescens immuncytokemi billeder viser SP-C-protein-niveauer (grøn) i føtale type II-celler eksponerede eller ikke (kontrol) til mekanisk belastning.. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå). Bar, 10 um. C) Western blot-resultaterne fra tre forsøg viser, at mekanisk stræk forøger SP-C-protein. N = 3; * P <0,05.

Discussion

I dette skrift beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af føtale type II epitelceller og fibroblaster, og at udsætte dem for mekanisk stimulation ved hjælp af Flexcell Strain Apparatus. Vi har anvendt denne teknik til at vurdere differentiering af epitelceller ^1,2 og til at studere receptoren og signalveje, der aktiveres af stretch ^3-9. Desuden kan denne fremgangsmåde også anvendes til at undersøge celle-responser induceret af mekanisk skade ^10,11. Proceduren er baseret på spaltning af lungevævet med collagenase. Den udnytter tendens type II-celler til at klumpe sammen efter fordøjelse. Vigtige trin under udførelsen af ​​denne teknik er hakkes vævet og til at lette fordøjelse af lungen og vask grundigt ikke-filtreret celler på 30 og 15 mikron masker for at lette filtrering af ikke-epitelceller og derfor at opnå større renhed af type II-celler .

Vores laboratorieformål membranes overtrukket med collagen eller laminin at simulere ECM sammensætning basalmembraner. Imidlertid, når cellerne udsættes for 20% forlængelse, kan celler løsnes fra substratet under strækning og fibronectin bør betragtes som et alternativ substrat.

En anden vigtig overvejelse er at undgå 100% sammenløb af cellemonolagene før strække, da dette kan fremme celle-til-celle kontakt snarere end celle-til-matrix kontakt og dermed celler kan ikke "føler" procentdelen af ​​forlængelsen nedsat ved protokollen.

Den Flexcell Strain Unit anvender et vakuum til at deformere en fleksibel bund dyrkningsplade. Anvendelsen af vakuum strækker hver membran over den centrale cylinder stillingen, skaber en ensartet radial og rundtgående stamme over membranoverfladen, og derfor giver equibiaxial distension, svarende til in vivo-betingelser (se tegning, skematisk oversigt video, med tilladelse Dr. AJ Banes Flexcelle International Corporation, www.flexcellint.com). Dette system giver en defineret, kontrolleret statisk eller cyklisk deformation af den angivne stammen regime. For at efterligne føtale vejrtrækning bevægelser en cyklisk strækning regime mellem 2,5-5% strækning på 40-60 cykler / minut anvendes. Der er ikke enighed om den procentdel af forlængelsen, at føtale lunge sanser under føtal vejrtrækning. Nogle forfattere mener, at 5% udspiling er passende ^12, mens andre forskere mener, at 2,5% er mere repræsentativt for in vivo betingelser ^13,14. At simulere konstant udspiling tryk, en 2,5% kontinuerlig stræk protokol anvendt. At efterligne lungeskade, 20% cyklisk strækning på 40 cykler / min anvendes. Potentielle begrænsninger ved denne teknik indbefatter forøgelse af deformation af celler podet i området af membranen perifere at belastningen stillingen. En anden begrænsning er den manglende evne til at tilvejebringe forlængelse større end 15-20%, hvis en høj cyklushastighed anvendes (over 40 cykler / minut).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5648
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase 1	Sigma-Aldrich	C0130
Collagenase 1A	Sigma-Aldrich	C9891
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
Screen cups	Sigma-Aldrich	CD1-1KT
Syringe filters	Fisher Scientific	09-754-25
100 micron nylon mesh	Small Parts, Inc.	CMN-100-D
30 micron mesh	Small Parts, Inc.	CMN-30-D
15 micron mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd.	NTX15
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Collagen-1	Collagen Biomed	PC0701
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Vitronectin	Sigma-Aldrich	V-0132
Elastin	Sigma-Aldrich	E-6402
Bioflex plate	Flexcell International	BF-3001U	Uncoated
Flexcell Strain Unit	Flexcell International	FX-5000