Summary
Mechanische krachten spelen een belangrijke rol in de longen de ontwikkeling en longschade. Hier wordt beschrijven een werkwijze voor knaagdier foetale long type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en blootstellen aan mechanische stimulatie met een
Abstract
Mechanische krachten die ontstaan in de baarmoeder door repetitieve ademhaling-achtige bewegingen en door vocht opgezette buik zijn van cruciaal belang voor een normale long ontwikkeling. Een belangrijk onderdeel van de long ontwikkeling is de differentiatie van de alveolaire type II epitheelcellen, de belangrijkste bron van pulmonale surfactant. Deze cellen nemen ook deel aan vocht homeostase in het alveolaire lumen, afweer, en letsel reparatie. Bovendien kan distale longparenchym cellen direct worden blootgesteld aan overdreven rek bij mechanische ventilatie na de geboorte. Echter, de precieze moleculaire en cellulaire mechanismen die longcellen voelen mechanische stimuli om long-ontwikkeling te beïnvloeden en longschade te bevorderen niet helemaal duidelijk. Hier bieden wij een eenvoudige en hoge zuiverheid methode om type II cellen en fibroblasten van knaagdieren foetale longen te isoleren. Vervolgens beschrijven we een in vitro systeem De Flexcell Strain eenheid mechanische stimulatie voor foetale cellen simuleren mechanische krachten infoetale long ontwikkeling of longschade. Deze experimentele systeem biedt een uitstekend hulpmiddel om de moleculaire en cellulaire mechanismen te onderzoeken in foetale long cellen blootgesteld aan te rekken. Met behulp van deze benadering, heeft ons laboratorium geïdentificeerd verschillende receptoren en signalering eiwitten die in mechanotransductie deel te nemen aan foetale long ontwikkeling en longschade.
Protocol
1. Coating van platen met ECM eiwitten
- Onder steriele omstandigheden, meng 120 ug van laminine met 12 ml koud steriel 1X PBS per plaat.
- Neem Bioflex onbehandelde platen en voeg 2 ml van de oplossing in elk putje (eindconcentratie laminine is 2 ug / cm 2). Ook kunnen andere ECM eiwitten worden gebruikt, zoals collageen-1 [10 ug / cm 2], fibronectine [5 ug / cm 2], vitronectine [0,5 ug / cm 2] elastine [10 ug / cm 2]. De coating techniek is vergelijkbaar met wat beschreven wordt voor laminine-coating. Zorg ervoor dat de putten zijn volledig gedekt door de oplossing.
- Wikkelen van de platen met kunststof en zet bij 4 ° C op een vlakke ondergrond nachts de laminin laten adsorberen op de bodem van de putten. In deze omstandigheden kan platen wordt ten minste een week met behoud goede ECM functie.
- De volgende dag, onder steriele omstandigheden, was de putten 3 keer met 1X PBS.
- Spoel de platen 3 keer met 1X PBS om unadsorbed eiwitten te verwijderen.
- Houd de platen bij 37 ° C in DMEM tot cellen geïsoleerd uit stap 2.14.
2. Isolatie van foetale knaagdieren long type II epitheelcellen
De dag voor isolatie hebben het scherm kopjes met verschillende grootte nylon mazen geautoclaveerd en klaar.
- Zorg voor foetale longen uit timed-drachtige muis / rat op E17-19 van de dracht. Breng het weefsel in een 50 ml conische buis met DMEM-medium en plaats het op het ijs.
- Merk digestie buffer in een 50 ml conische buis (10 ml). Voor dit volume, wordt het longweefsel van ongeveer 20 foetussen van muizen / ratten gebruikt.
8,5 ml DMEM
0,5 ml 500mm HEPES pH 7,4
5 mg Collagenase een
5 mg Collagenase 1A
1 ml Kip serum, warmte geïnactiveerd - Meng goed totdat alle componenten zijn opgelost en filtreer door een 0,2 micron spuit filter in de steriele kap. Plaats de conische buis met de spijsvertering buffer in een waterbad bij 37 ° C.
- Verwijder de DMEM medium uit de conische buis uit stap 2.1 en overdragen het weefsel in een steriele Petri schaal.
- Gehakt de longen en met steriele scharen en scheermes om weefselstukken minder dan 1 mm en het weefsel te zetten in de conische buis met de voorverwarmde digestie buffer bij stap 2.3.
- Verteren van het weefsel door en neer te pipetteren:
100 maal met 10 ml pipet
100 maal met 5 ml pipet
100 keer met Pasteur pipet - Centrifugeer de homogenaat op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig het supernatant van aspiratie en resuspendeer de pellet die de cellen in 15 ml DMEM plus 20% FBS.
- Haal het scherm cups met 100 -, 30 - en 15-micron nylon mazen en plaats eem op steriele 150 ml bekers.
- Voeg cel homogenaat vanaf stap 2.8 en opeenvolgend filteren door middel van 100 -, 30 - en 15-micron gaas cups.
- Verzamelen samengeklonterd ongefilterde cellen van de 30 - en 15-micron mazen na verschillende wasbehandelingen met DMEM plus 10% FBS voor het filtreren van niet-epitheelcellen vergemakkelijken.
- Verwijder het filtraat van de 15 micron mesh die meestal bevat fibroblasten.
- Zuiver ander type II cellen door incubatie cellen stap 2,11 in 75 cm2 flessen gedurende 30 min (approximatelly10 ml celsuspensie per fles).
- De bovenstaande en centrifugeer op 1300 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur pellet de cellen.
- Verwijder voorzichtig het supernatant van aspiratie en resuspendeer de pellet die de cellen in serum-vrij DMEM. Het volume van resuspensie afhankelijk van de hoeveelheid weefsel verwerkt. Ongeveer we plaat het equivalent van cellen van een foetus in elk putje (2 ml) om Achiavond tussen 60-70% confluentie de volgende dag.
- Het bord van de celsuspensie op Bioflex zes-well platen vooraf bekleed met laminine of met fibronectine.
3. Isolatie van foetale knaagdier longfibroblasten
- Volg dezelfde stappen hierboven beschreven voor type II-cellen geïsoleerd tot 2.11.
- Neem het filtraat van de 15 micron mesh (zonder voorafgaande wassen, ongeveer volume 10-15 ml) en plaat op 75 cm2 bij 37 ° C gedurende 30-60 min om fibroblasten te houden.
- Zuig het supernantant en 's nachts te vervangen door serum-vrij DMEM en incubeer.
- De volgende dag oogsten cellen met 0,25% (gew / vol) trypsine in 0,4 mM EDTA en plaat ze op Bioflex platen vooraf bekleed met fibronectine.
4. Experimentele systeem mechanische stimulatie aan longcellen
- Zaad van de cellen (ongeveer 50% samenvloeiing) op Bioflex kweekplaten in serum-vrij DMEM (2 ml / putje) en laat ze hechten en SPREadvertentie voor minstens 6 uur voor de experimenten. In het algemeen ons laboratorium houdt cellen in cultuur voor ongeveer 24 uur voor het toepassen van mechanische belasting. Indien een bepaald aantal cellen voor de experimenten, na isolatie, zijn Type II cellen gehandhaafd serumvrij DMEM 75 cm2 flessen en de volgende dag cellen getrypsiniseerd, geteld en gezaaid.
- De volgende dag media worden vervangen door vers serumvrij DMEM (2 ml / putje) en Bioflex platen zijn gemonteerd in een Flexcell FX-5000 Strain eenheid. Monolayers niet hoger dan 80% confluent zijn voor de initiatie van de experimenten.
- Equibiaxial stam wordt toegepast op de membranen. Het regime van belasting is afhankelijk van simulatie van mechanische krachten in vivo (zie bespreking).
- Cellen gekweekt op niet-gestrekte membranen gekweekt in parallel worden gebruikt als controles.
- Aan het einde van de experimenten kan worden verwerkt monolayers wijzigingen op genexpressie (bijvoorbeeld oppervlakteactieve eiwit C) analyserendoor real-time-PCR, eiwit overvloed door Western blot, enz. Ook kan monolagen worden vastgesteld voor immunocytochemie experimenten. Voor deze techniek na fixatie worden silastic membranen gesneden uit de platen gemonteerd op glasplaatjes met 10-20 il water als montagemiddel voor permeabilisatie en incubatie met antilichamen. Supernatant kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid van groeifactoren, cytokines, etc. onderzoeken
5. Representatieve resultaten
Figuur 1 en Figuur 2 tonen representatief fase contrast's van muizen E18 foetale type II-cellen geïsoleerd volgens de techniek beschreven in dit manuscript.
Figuur 3 toont dat de mechanische spanning induceert van foetale type II epitheelcellen met oppervlakte eiwit C als marker.
Figuur 1. Reprepresentatieve fase-contrast-foto genomen vlak na isolatie met de samengeklonterd verschijning van foetale type II cellen.
Figuur 2. E18 foetale type II epitheliale cellen werden geïsoleerd zoals hier en uitgeplaat beschreven Bioflex bekleed met laminine. Foto werd de volgende dag na niet-gestrekte cellen werden in paraformaldehyde. De zuiverheid van de cellen werd bepaald op 90 ± 5% van het microscopische analyse van epitheliale cel morfologie en immunokleuring voor SP-C.
Figuur 3. Foetale type II epitheliale cellen werden blootgesteld aan 5% cyclische belasting van 40 cycli / minuut voor 16 uur. A) Northern blot oppervlakteactieve eiwit C (SP-C) mRNA expressie blijkt dat spanning induceert type II celdifferentiatie met verschillende substraten ECM . + / - Tekens vertegenwoordigen belichting of niet srespectievelijk te trainen,. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde + / - SEM, n = 3; * P <0,05 B) Fluorescentie immunocytochemie beelden tonen SP-C-eiwit niveau (groen) in foetale type II cellen blootgesteld of niet (controle) om de mechanische belasting.. Kernen werden tegengekleurd met DAPI (blauw). Bar, 10 pm. C) Western blot resultaten van drie experimenten blijkt dat de mechanische rek groter SP-C-eiwit. N = 3; * P <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit manuscript beschrijven we een methode om foetale type II epitheelcellen en fibroblasten te isoleren en om ze bloot te stellen aan mechanische stimulatie met behulp van de Flexcell Strain Apparatus. We hebben gebruik gemaakt van deze techniek om differentiatie van epitheelcellen 1,2 beoordelen en receptor en signaalwegen geactiveerd door stretch 3-9 te bestuderen. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om cel responsen veroorzaakt door mechanische schade 10,11 onderzoeken. De procedure is gebaseerd op de vertering van de longen met collagenase. Het maakt gebruik van de neiging van type II cellen samenklonteren na digestie. Belangrijke stappen bij het uitvoeren van deze techniek zijn hakken het weefsel goed om de spijsvertering van de long en het wassen grondig de niet-gefilterde cellen op 30 en 15 micron mazen van de filtratie van niet-epitheliale cellen te vergemakkelijken en daarom de zuiverheid van het type II cellen te bereiken vergemakkelijken .
Ons laboratorium maakt gebruik van membranes bedekt met collageen of laminine aan de ECM samenstelling van de basale membranen te simuleren. Echter, wanneer cellen worden blootgesteld aan 20% rek kan cellen los van het substraat tijdens rek en fibronectine moet worden beschouwd als een alternatief substraat.
Een belangrijke overweging om te voorkomen dat 100% samenvloeiing van celmonolagen voor rekken, aangezien deze kan cel-cel contact dan cel-matrix contact derhalve bevorderen en cellen zou niet "voelt" percentage rek ingesteld door het protocol.
De Flexcell Strain eenheid maakt gebruik van een vacuüm te vervormen een flexibele bodem cultuur plaat. Toepassing van vacuüm strekt zich elk membraan over de centrale cilinder post, het creëren van een uniforme radiale en omtrek stam over het membraan oppervlak en daarmee het verstrekken van equibiaxial buik, vergelijkbaar met in vivo voorwaarden (zie cartoon, schematisch overzicht video, met toestemming, dr. AJ Banes Flexcel International Corporation, www.flexcellint.com). Dit systeem zorgt voor een bepaalde, gecontroleerde statische of cyclische vervorming door de opgegeven stam regime. Om foetale ademhalingsbewegingen na te bootsen van een cyclisch traject regime tussen de 2,5-5% rek bij 40-60 cycli / minuut wordt toegepast. Er is geen overeenstemming over het percentage rek dat foetale long zintuigen tijdens de foetale ademhaling. Sommige auteurs zijn van mening dat 5% buik geschikt is 12 terwijl andere onderzoekers stellen dat 2,5% meer representatief is voor de in vivo condities 13,14. Om een constante buik druk te simuleren, wordt een 2,5% aaneengesloten protocol dat wordt gebruikt. Om longschade na te bootsen, 20% cyclische rek bij 40 cycli / min wordt gebruikt. Mogelijke beperkingen van deze techniek zijn de toename van de vervorming van cellen uitgezet in het gebied van het membraan perifere het laden post. Een andere beperking is het onvermogen om rek van meer dan 15-20% geven als een hoge cyclussnelheid wordt (dan 40 cycli / min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ondersteund door NIH-subsidie HD052670.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
