Summary
Mekanik kuvvetler akciğer gelişimi ve akciğer hasarı önemli bir rol oynamaktadır. Burada, kemirgen fetal akciğer tip II epitel hücreleri ve fibroblastlar izole etmek ve bir kullanarak mekanik stimülasyonu almaları için bir yöntem tarif
Abstract
Tekrarlayan solunum benzeri hareketleri ve sıvı distansiyonu ile utero üretilen mekanik güçlerin normal akciğer gelişimi için kritik öneme sahiptir. Akciğer gelişimi temel bileşeni, alveolar tip II epitel hücreleri, pulmoner surfaktan en önemli kaynağı bölünme. Bu hücreler aynı zamanda alveolar lümen, konak savunma ve yaralanma tamir sıvı dengesinin katılırlar. Ayrıca, distal akciğer parankima hücreleri doğrudan doğum sonrası mekanik ventilasyon sırasında abartılı streç maruz kalabilirler. Ancak, akciğer hücreleri akciğer gelişimini etkilemek için ve akciğer hasarı teşvik mekanik uyarıcılar hissedebiliyorum hangi hassas moleküler ve hücresel mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, kemirgen fetal akciğerlerden tip II hücreleri ve fibroblastlar yalıtmak için basit ve yüksek saflıkta bir yöntem sunar. Sonra, mekanik kuvvetleri taklit, fetal hücreler mekanik uyarılması için, in vitro sistemi, Flexcell Zorlanma Birimi bir tariffetal akciğer gelişimini veya akciğer hasarı. Bu deneysel sistem germek maruz fetal akciğer hücrelerinde moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için mükemmel bir araç sunmaktadır. Bu yaklaşımı kullanarak, laboratuvar fetal akciğer gelişimi ve akciğer hasarında mechanotransduction katılmak çeşitli reseptörler ve sinyal proteinlerini tespit etti.
Protocol
1. ECM proteinleri ile plakaların Kaplama
- Steril koşullar altında, plaka başına soğuk steril 1X PBS 12 ml ile laminin 120 mikrogram karıştırın.
- Bioflex tedavi edilmemiş levhalar alın ve her kuyuya çözüm 2ml ekleyin (laminin son konsantrasyonu 2 mg / cm 2 'dir). Alternatif olarak, diğer proteinler gibi ECM'yi kolajen-1 olarak, kullanılan olabilir [10 ug / cm 2], fibronektin [5 ug / cm 2], vitronektin [0,5 ug / cm 2] veya elastin [10 ug / cm 2]. Kaplama tekniği bunun laminin-kaplanması için tarif edilene benzer. Kuyular tamamen çözümü kapsamında olduğundan emin olun.
- Plastik tabak sarın ve kuyu dibine tutunmasını laminin izin gecede düz bir yüzey üzerinde 4 ° C de koydu. Hala iyi ECM işlevini koruyarak Bu koşullarda, tabaklar en az bir hafta saklanabilir.
- Ertesi gün, steril koşullar altında, 1X kuyular PBS ile 3 defa yıkanır.
- Plakalar adzorbe edilmeyen proteinleri kaldırmak için 1X PBS ile 3 defa çalkalayın.
- Hücreler adım 2.14 izole edilene kadar 37 ° C'de DMEM içinde plaka tutmak.
2. Fetal kemirgen Akciğer tip II epitel hücrelerinin izolasyonu
Izolasyon önceki gün otoklavlanmış ve hazır farklı boyut naylon kafesleri ile ekran bardak var.
- Gebeliğin E17-19 fare / sıçan zamanlı gebe fetal akciğer edinin. DMEM ortamı içeren 50 ml konik tüpe doku aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
- 50 ml'lik bir konik tüpe sindirim tampon hale: (10 ml). Bu birim için, fare / sıçan yaklaşık 20 fetusa ait akciğer dokusu kullanılır.
8.5 ml DMEM
0.5 ml 500mM Hepes pH 7.4
5 mg Kollajenaz 1
5 mg Kollajenaz 1A
1 ml Tavuk serum, inaktif ısı - Tüm bileşenleri steril kaput içinde 0.2 mikron şırınga filtre ile çözünmüş ve filtre kadar iyice karıştırınız. 37 su banyosunda sindirim tampon içeren konik tüp ° C yerleştirin
- Adım 2.1 'den konik tüp DMEM ortamı çıkarın ve steril Petri kabına doku aktarın.
- 1 mm'den daha az doku parçaları yapmak ve adım 2.3 'önceden ısıtılmış sindirim tampon içeren konik tüp içine doku aktarımı için iyi steril makas veya jilet ile akciğerlere kıyma.
- Aşağı pipetleme tarafından doku sindirmek:
10 ml pipet ile 100 defa
5 ml pipet ile 100 defa
Pasteur pipeti ile 100 defa - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1300 rpm'de santrifüje Homojenat.
- Dikkatle aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak ve pelet 15 ml DMEM artı% 20 FBS içeren hücreler yeniden askıya.
- , - 30 - 100 ekran bardak çıkarın ve 15 mikron naylon kafesleri ve yer thSteril 150 ml bardak üzerinde em.
- Adım 2.8 hücre Homojenat ekleyin ve sırasıyla 100 süzülmeye -, 30 - ve 15-mikron örgü ekran bardak.
- Non-epitelyal hücrelerin filtrasyon kolaylaştırmak için DMEM artı% 10 FBS ile çok yıkamadan sonra ve 15 mikron kafesleri - clumped 30 olmayan filtre hücreleri toplayın.
- Çoğunlukla fibroblastlar içeren 15 mikronluk bir elekten süzüntü atılır.
- 30 min (şişeye başına hücre süspansiyonu approximatelly10 ml) 2-75 cm şişeler içerisinde aşama 2.11 hücreleri tarafından daha kuluçkaya tip II hücreleri saflaştırmak.
- Pelet hücreleri için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1300 rpm'de süpernatan toplamak ve santrifüj.
- Dikkatle aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak ve pelet serumsuz DMEM hücre içeren yeniden askıya. Yeniden süspanse hacmi işlenmiş doku miktarına bağlı olarak değişir. Yaklaşık olarak, bu plaka hücreler denk Achi etmek için (2 ml) de, her biri fetus elde edilenErtesi gün eve% 60-70 arasında birbirine karışmış.
- Bioflex altı iyi tabaklarda Plaka hücre süspansiyonu laminin ve fibronektin ile önkaplamalı.
3. Fetal kemirgen akciğer fibroblast İzolasyonu
- 2.11 kadar tip II hücrelerin izolasyonu için yukarıda açıklanan aynı adımları izleyin.
- Fibroblastlar yapışma sağlamak için 30-60 dakika boyunca 37 ° C'de 75 cm-2 üzerine ve plaka, 15 mikron meş (yaklaşık 10-15 ml hacim olduğu önceki yıkama olmadan) gelen süzüntü al.
- Süpernatantından aspire ve geceleme serumsuz DMEM ve inkübe ile değiştirin.
- Ertesi gün,% 0.25 (ağırlık / hacim) 0.4 mM EDTA ve fibronektine ile önkaplamalı Bioflex plakalar üzerine plakası bunları tripsin ile hücreler hasat.
4. Akciğer hücreleri için mekanik uyarılması için deneysel sistem
- Serumsuz DMEM (2 ml / kuyu) ve bunların ekleyin ve spre içeri Bioflex kültür plakaları üzerine tohum hücreleri (yaklaşık% 50 konfluent)deneyler önce en az 6 saat reklam. Genel olarak laboratuvar mekanik zorlama uygulamadan önce yaklaşık 24 saat için kültür hücreleri korur. Hücreler belirli bir sayıda deneyler için gerekli olduğu durumda, izolasyon sonra, tip II hücreler 75 cm 2 matara ve ertesi gün, hücreleri, tripsinize sayılır ve sonra tohumlanmıştır serumsuz DMEM tutulur.
- Ertesi gün, taze ortam serumsuz DMEM (2 ml / çukur) ve levhalar bioflex ile değiştirilir, bir Flexcell FX-5000 Suş birimi içinde monte edilmiştir. Monotabaka deneyler başlamadan önce hiçbir büyük 80 den% birleşik olmalıdır.
- Equibiaxial suşu membranları uygulanır. Gerilme rejimi (bakınız tartışma) in vivo mekanik güçlerin simülasyon bağlı olarak değişir.
- Paralel kültüre olmayan gergin zarlar üzerinde yetiştirilen hücreler kontrol olarak kullanılır.
- Deneyler sonucunda, mono tabakalar gen ifadesi üzerine değişiklik (örneğin yüzey aktif protein C) analiz etmek için işlenebilirWestern Blot, vb, zaman-PCR gerçek bir protein bolluğu Ayrıca, mono tabakaları immünsitokimya deneylerde tespit edilebilir. Bu teknik için, tespit sonrasında, silastik membranlar plakalardan kesilir ve antikorlar ile permeabilization ve inkübasyon önce montaj ajan olarak su 10-20 ul kullanılarak cam slaytlar üzerine monte edilmiş. Süpernatant da büyüme faktörleri, sitokinler, vs varlığının belirlenmesi için de kullanılabilir
5.. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1 ve E18 fetal fare tip II hücrelerin Şekil 2 gösterisi temsilcisi faz-kontrast fotoğrafları bu makalede açıklanan yöntemi kullanarak izole.
Şekil 3 bu mekanik zorlama bir belirteç olarak surfaktan protein-C kullanarak fetal tip II epitel hücrelerin farklılaşmasını uyarır göstermektedir.
Şekil 1. Tecrüberesentative faz-kontrast fotoğrafın sağ fetal tip II hücrelerin clumped görünümünü gösteren izolasyon sonra alınır.
Laminin ile kaplanmış bioflex plakaları üzerine kaplanmış ve burada tarif edildiği gibi Şekil 2. E18 fetal tip II epitel hücreleri izole edildi. Olmayan gergin hücreleri paraformaldehid tespit edildi sonra Fotoğraf ertesi gün çekildi. Hücre 90 saflıkta olduğu tespit edildi ± SP-C için epitel hücre morfoloji ve immun mikroskopik analizi ile% 5 idi.
Şekil 3. Fetal tip II epitel hücreleri 40 devir / dk için 16h azından% 5 siklik suşu maruz bırakıldı. Yüzey aktif protein C (SP-C) o suşu farklı ECM substrat kullanılarak tip II hücre farklılaşması indüklemektedir gösteren mRNA ekspresyonu A) Northern blot . + / - Işaretler s maruz kalma ya da temsilsırasıyla, eğitmek. Veriler ortalama olarak sunulmaktadır + / - SEM, n = 3; * p <0.05 B) mekanik zorlamalara SP-C proteini maruz fetal tip II hücrelerinde düzeyleri (yeşil) ya da (kontrol) gösteren Floresans immünsitokimya görüntüler.. Çekirdekler DAPI (mavi) ile zıt edildi. Bar, bu mekanik gerilmenin gösteren üç deneyler 10 mikron. C) Western Blot sonuçları SP-C proteini artırır. N = 3; * p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda, fetal tip II epitel hücreleri ve fibroblastlar yalıtmak ve Flexcell Gerinim Aparatı kullanarak mekanik stimülasyonu almaları için bir metodu tanımlar. Biz epitel hücrelerinin farklılaşması 1,2 değerlendirmek ve reseptör ve streç 3-9 aktive sinyal yolları incelemek için bu tekniği kullandık. Buna ek olarak, bu yöntem ayrıca mekanik yaralanması 10,11 uyarılan hücre cevabını araştırılması için de kullanılabilir. Prosedürü kollajenaz ile akciğer dokusunda sindirim dayanmaktadır. Sindirim sonrası bir araya gelme tip II hücrelerin eğilimi yararlanır. Bu tekniğin gerçekleştirilirken önemli adımları akciğer sindirim ve non-epitelyal hücreleri filtrasyon kolaylaştırmak için ve bu nedenle Tip II hücrelerinin büyük saflıkta elde etmek için iyice 30 ve 15 mikron kafes üzerine olmayan filtre hücreleri çamaşır kolaylaştırmak için de doku kıyma olan .
Laboratuvarımız m kullanırembranes kolajen ya da temel zarların ECM bileşimi simüle etmek için laminin ile kaplanır. Bununla birlikte, hücreler% 20 bir uzamaya maruz kaldığında, hücreler streç substrata sırasında ayırmak olabilir ve fibronektine alternatif bir substrat olarak kabul edilmelidir.
Başka bir önemli husus, bu hücreden hücreye iletişim yerine hücre-matriks temas teşvik edebilir ve bu nedenle hücreler "duygusu" tarafından kurulan uzama yüzdesi değil belki verilen germek için önce hücre mono tabakaları% 100 izdiham, kaçınmaktır protokolü.
Flexcell Suş Birim esnek bir alt kültürü plakası deforme etmek üzere bir vakumlu kullanır. Vakum uygulaması membran yüzeyi boyunca tek radyal ve çembersel gerginlik yaratmak ve bu nedenle (izni ile, karikatür, şematik videoyu görmek, Dr AJ Banes Flex in vivo koşullarda benzer equibiaxial dolgunluk sağlayarak, merkezi silindir yazılan boyunca her membran uzanıyorhücre International Corporation, www.flexcellint.com). Bu sistem belirtilen gerilme rejimi tarafından tanımlanan, kontrollü statik veya siklik deformasyon sağlar. Fetal solunum hareketleri taklit etmek için 40-60 devir / dakikada 2.5-5% streç arasında döngüsel bir streç rejimi uygulanır. Uzama yüzdesi anlaşma yok fetal solunum sırasında fetal akciğer duyuları söyledi. Bazı yazarlar, diğer araştırmacılar% 2.5 in vivo koşullarda 13,14 olarak daha fazla temsilcisi olduğunu iddia ise% 5 distansiyonu uygun 12 olduğuna inanıyoruz. Sabit distansiyonu basınç simülasyonu için,% 2.5 sürekli streç protokolü kullanılır. 40 devir / dk 'da akciğer hasarı taklit etmek için,% 20 siklik streç kullanılır. Bu tekniğin potansiyel sınırlamaları yükleme yazılan periferal membran alanı tohumlanmış hücrelerinin deformasyon artış vardır. Bir diğer kısıtlılık yüksek bir çevrim oranı kullanılırsa uzaması daha büyük% 15-20 sağlamak için yetersizlik (40 devir / dk üzerinde olması).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
NIH hibe HD052670 tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Collagenase 1 | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Collagenase 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Screen cups | Sigma-Aldrich | CD1-1KT | |
| Syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-25 | |
| 100 micron nylon mesh | Small Parts, Inc. | CMN-100-D | |
| 30 micron mesh | Small Parts, Inc. | CMN-30-D | |
| 15 micron mesh | Dynamic Aqua-Supply Ltd. | NTX15 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Collagen-1 | Collagen Biomed | PC0701 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Vitronectin | Sigma-Aldrich | V-0132 | |
| Elastin | Sigma-Aldrich | E-6402 | |
| Bioflex plate | Flexcell International | BF-3001U | Uncoated |
| Flexcell Strain Unit | Flexcell International | FX-5000 |
References
- Sanchez-Esteban, J., Tsai, S. W., Sang, J., Qin, J., Torday, J. S., Rubin, L. P. Effects of mechanical forces on lung-specific gene expression. Am. J. Med. Sci. 316, 200-204 (1998).
- Sanchez-Esteban, J., Cicchiello, L. A., Wang, Y., Tsai, S. W., Williams, L. K., Torday, J. S., Rubin, L. P. Mechanical stretch promotes alveolar epithelial type II cell differentiation. J. Appl. Physiol. 91, 589-595 (2001).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Cicchiello, L. A., Rubin, L. P. Cyclic mechanical stretch inhibits cell proliferation and induces apoptosis in fetal rat lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 282, L448-L456 (2002).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Gruppuso, P. A., Rubin, L. P. Mechanical stretch induces fetal type II cell differentiation via an epidermal growth factor receptor-extracellular-regulated protein kinase signaling pathway. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 30, 76-83 (2004).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Lee, N., Silbert, O., McKnight, N. L., Frangos, J. A. Strain-induced fetal type II epithelial cell differentiation is mediated via cAMP-PKA-dependent signaling pathway. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291, L820-L827 (2006).
- Sanchez-Esteban, J., Wang, Y., Filardo, E. J., Rubin, L. P., Ingber, D. E. Integrins {beta}1, {alpha}6, and {alpha}3 contribute to mechanical strain-induced differentiation of fetal lung type II epithelial cells via distinct mechanisms. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 290, L343-L350 (2006).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Soto-Reyes, D., Lee, H. S., Warburton, D., Sanchez-Esteban, J. Mechanical stretch promotes fetal type II epithelial cell differentiation via shedding of HB-EGF and TGF-alpha. J. Physiol. 587, 1739-1753 (2009).
- Wang, Y., Maciejewski, B. S., Drouillard, D., Santos, M., Hokenson, M. A., Hawwa, R. L. A role for caveolin-1 in mechanotransduction of fetal type II epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 298, L775-L783 (2010).
- Lee, H. S., Wang, Y., Maciejewski, B. S., Esho, K., Fulton, C., Sharma, S. Interleukin-10 protects cultured fetal rat type II epithelial cells from injury induced by mechanical stretch. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 294, L225-L232 (2008).
- Hawwa, R. L., Hokenson, M. A., Wang, Y., Huang, Z., Sharma, S., Sanchez-Esteban, J. IL-10 inhibits inflammatory cytokines released by fetal mouse lung fibroblasts exposed to mechanical stretch. Pediatric Pulmonology. , (2011).
- Kitterman, J. A. The effects of mechanical forces on fetal lung growth. Clin. Perinatol. 23, 727-740 (1996).
- Harding, R. Fetal breathing movements. The Lung: Scientific Fountations. Crystal, R. G., West, J. B., Banes, P. J. , 2nd Ed, Lippincott-Raven. Philadelphia. 2093-2104 (1997).
- Harding, R., Liggins, G. C. Changes in thoracic dimensions induced by breathing movements in fetal sheep. Reprod. Fertil. Dev. 8, 117-124 (1996).
