MR-guided Forstyrrelse af blod-hjerne barrieren ved hjælp af Transcranial fokuseret ultralyd i en rottemodel

Summary

Mikroboble-medieret fokuseret ultralyd afbrydelse af blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​er en lovende metode til ikke-invasiv målrettet lægemiddelafgivelse i hjernen

Abstract

Fokuseret ultralyd (FUS) afbrydelse af blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​er et stadig undersøges teknik til at omgå BBB ^1-5. BBB er en væsentlig hindring for farmaceutiske behandlinger af hjernesygdomme, da den begrænser passagen af molekyler fra vaskulaturen i hjernevæv molekyler mindre end ca 500 Da i størrelse ^6. FUS induceret BBB forstyrrelser (BBBD) er en midlertidig og reversibel ⁴ og har en fordel i forhold til kemiske midler for at inducere BBBD ved at være meget lokaliseret. FUS induceret BBBD tilvejebringer et middel til at undersøge virkningerne af en lang række terapeutiske midler på hjernen, der ellers ikke ville være leveres til vævet i tilstrækkelig koncentration. Mens en bred vifte af ultralyd parametre har vist sig gode til at forstyrre BBB ^2,5,7, er der flere kritiske trin i den eksperimentelle procedure for at sikre en vellykket forstyrrelser med præcis målretning. Denne protokolol skitserer, hvordan man opnår MRI-styrede FUS inducerede BBBD i en rotte model, med fokus på den kritiske dyret forberedelse og mikroboblesystemer håndtering trin i eksperimentet.

Protocol

1. Ultralyd og MR Setup

En MRI-kompatibel tre akser fokuseret ultralyd-systemet blev anvendt i denne undersøgelse (FUS Instruments, Inc., Toronto, Ontario, Canada). To forskellige ultralydstransducere blev anvendt: en intern konstrueret 551,5 kHz sfærisk fokuseret transducer (krumningsradius = 60 mm, udvendig diameter = 75 mm, indvendig diameter = 20 mm) og en 1,503 MHz, 8-sektor-array med integreret PZT hydrofon (Imasonic Inc., Voray-sur-L'Orgnon, Frankrig), drevet som et enkelt element sfærisk fokuseret transducer (FN = 0,8, blænde = 10 cm). En MR-kompatibel PVDF modtager ⁸ blev brugt til at indspille akustiske emissioner, når 551,5 kHz transducer blev brugt. Hvis forskelligt udstyr der anvendes, er følgende foreslået:

1. Vælge en passende kalibreret ultralydtransducer med en centerfrekvens på mellem 0,25 MHz -1,5 MHz og en f-tal (krumningsradius / åbning) i 1 eller mindre.
2. Placer et vandbad filled med varm, afgasset, deioniseret vand på bunden af ​​en 1,5 T eller 3 T MRI. Vandbadet bør have en top-plade, som kan holde dyrene. Monter ultralydstransducer i tanken på en MR kompatibelt tre-akse positionering scene eller et system ^9, mod vandoverfladen.
3. Kør transducerkablet til ultralyd kørsel udstyr gennem en penetration panel.
4. Generer transduceren kørsel signal ved hjælp af en funktion generator og effektforstærker. Anvender en ekstern matchende kredsløb for at minimere reflekteret elektrisk strøm.
5. Kende transduceren brændvidde, transduceren fokus stille vandoverfladen og sonikeres vandoverfladen for at generere en synlig vandfontæne. Trin 1,6 og 1,7 beskrive, hvordan du registrerer fokus ved hjælp af den genererede vand springvand. En mere nøjagtig metode til lokalisering af fokus, der omfatter sonikering en varmeabsorberende gel og billeddannelse den resulterende temperaturstigning ved brændpunktet med MRI, kan findes i ^{9 <}/ Sup>.
6. Markerer placeringen af ​​fokus ved hjælp af en markør, som vil være synlig på MR-billeder. Dette kan gøres ved hjælp af en plade med et centralt hul, som kan fyldes med vand, når de placeres i fokus. Den vandfyldte hul vil være synlig på MRI og vil give fokale punkter i to planer, medens koordinater i den aksiale retning af transduceren kan bestemmes ud fra vandoverfladen.
7. Ved hjælp af en 3-fly Localizer sekvens, billede fokus markør og registrere placeringen af ​​fokus i MRI-koordinatsystem.
8. At overvåge akustiske emission montere en MR-kompatibel hydrofon ^8, der anvendes som en passiv kavitation detektor (PCD) i vandbad rettet mod transduceren fokus eller anvende en transducer med integreret hydrofon.
9. Kør PCD-kabler til en rækkevidde kort, der er tilstrækkeligt hurtigt til at fange serier på op til 10 ms ved PRF'er op til 2 Hz (f.eks ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada). Kabler skal være jordet til Penestrering panel eller RF-skjold for at minimere støj.

2. Animal Forberedelse

1. Bedøve dyrene med isofluoran gas. Idet isofluoran har en virkning på BBB forstyrrelser ^10, skal dyrene fjernes fra gas 10 minutter før starten af eksperimentet. Sted okulær smøremiddel salve i hvert øje ved starten af ​​anæstesi for at beskytte cornea fra udtørring eller anden skade.
2. Ved hjælp af en elektrisk barbermaskine barbere pelsen fra toppen af ​​dyrets hoved og hals, derefter fjerne den resterende pelsen ved hjælp af et hårfjerningsmiddel (f.eks Nair, Church & Dwight Co, Princeton, NJ, USA) og skyl hovedbunden med mild sæbe og vand.
3. Forbered halen med en betadin hud scrub efterfulgt af en bridine vask. Udføre en afsluttende wipedown med alkohol for at visualisere halevenen.
4. Indsætte en 22 gauge kateter med tre-vejs stophane i halevenen og skylles med heparin / saltvand-blanding (33 U / ml) for at forhindre koageldannelsei kateteret.
5. Levere injicerbare anæstetika (40-50 mg / kg ketamin 10 mg / kg xylazin) via intramuskulær injektion, og fjerne dyret fra isofluoran.
6. Anbring det anæstetiserede dyr liggende på ultralyd positioneringssystemet med toppen af ​​hovedet kontakt vandbadet gennem et hul i den øverste plade (fig. 1). En lille mængde af ultralyd gel måske påføres toppen af ​​dyrets hoved for at minimere chancen for fanget airbubbles.
7. Tape benene til positioneringssystem. Hovedet kan holdes på plads ved hjælp af enten en bid bar, hvis den er tilgængelig, eller tape placeret solidt over hagen.
8. Dæk dyret med et håndklæde og cirkulerende vand tæppe for at holde den varm.

3. Target Selection

1. Erhverve basislinien aksial _{T2-vægtede og} T1-vægtede MR-billeder af hjernen. Hvis du bruger en 1,5 T MR-og dedikeret hoved-størrelse RF-modtager overfladespolen, egnet scen parametre kunne være:
   
   T ₂ vægtet: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
   T ₁ vægtet: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms

2. Vælg målet fra T _2-vægtede scanninger, undgå hjertekamrene og hjernen midterlinjen, og vælge en mid-hjerne dybde.
3. Flyt transduceren fokus til målet placering.

4. Mikrobobler Forberedelse

Definity mikrobobler (Lantheus Medical Imaging, MA, USA) bruges af flere grupper til mikroboble medierede FUS inducerede BBBD ^2,5,7. Passende doser for andre mikroboblepræparater typer kan findes i litteraturen ^11,12.

1. Aktiver Definity mikroboblerne og langsomt udarbejde et lille volumen i en 1 ml sprøjte med en 18-gauge kanyle.
2. Fjerne indfanget luft fra sprøjten ved forsigtigt at bevæge stemplet frem og tilbage. Ikke på sprøjten, da dette kan bryde bobler.
3. Fortynde Definity i normal saltvand i et forhold på 10:01 saltvand til Definty ved langsomt at injicere det påkrævede volumen af ​​Definity i en sprøjte med saltvand. Hvis en infusion levering anvendes, kan Definity fortyndes yderligere, til 50:1 eller 100:1.
4. Vend forsigtigt sprøjten grundigt blande Definity og saltvand, indtil en ensartet udseende opnås. Forsigtig inversion af sprøjten umiddelbart før injektion kan ligeledes være nødvendig, hvis boblerne er begyndt at flyde ud af suspensionen.
5. Beregne den krævede dosis volumen baseret på 0,02 ml / kg Definity eller 0,2 ml / kg af opløsningen (i 10:01 fortynding).

5. Ultralyd Levering

1. Indstil lydbehandling parametre, ved hjælp af lav arbejdscyklus brister, ikke kontinuerlig bølge sonications. Passende sonikering parametre på 0,5 MHz er 0,23 MPa in situ tryk, 10 ms burst ved 1 Hz PRF, 2 min. total sonikering tid. 1,5 MHz passende in situ tryk falder omkring 0,45 til 0,5 MPa.

_content "> passende pres på forskellige frekvenser kan estimeres ved hjælp af en mekanisk indeks på 0,46 ^13.

2. Kontrollere, at dyrets hoved stadig er koblet til vandet.
3. Injicer mikroboblerne langsomt i halevenen kateteret og skylles med 0,5 ml normalt saltvand. Begynde lydbehandling samtidig med starten af ​​injektion.

6. MRI Evaluering af behandlingsresultatet

1. Efter sonikering et MRI-kontrastmiddel injiceres (f.eks 0,2 ml / kg Omniscan, GE Healthcare) via halevenen kateter, efterfulgt af 0,5 mL saltvandsskylning.
2. Udføre _T1-vægtede billeddannelse indtil kontrasten top har passeret. Lydbehandling lokaliteter, som med succes er blevet forstyrret, vil udvise større forøgelse end det omgivende væv.
3. Udfør T _2-vægtet imaging at kontrollere for ødem. Højt signal ved sonikering steder er indikativt for ødem.

7. RepræsentantResultater

MRI-kontrastmidler med held kan afgives gennem BBB ved hjælp fokuseret ultralyd og cirkulerende mikrobobler. Figur 2 viser typisk præ-og post-FUS T _1-w billeder. Figur 2B viser en kontrast forbedret (CE) T _1-w billede med forskellige knudepunkter åbninger i fire ultralydsbehandlede steder. Lydbehandling steder 1 og 2 viser særligt lyse ekstraudstyr. I Fig.3 steder 1 og 2 ses også at svare til T _2-w højt signal, der angiver ødem.

Omfanget af T _2-w ødem kan undertiden være lettere visualiseret på sagittale skiver. Figur 4 viser CE-T _1-W og T _2-w sagittale skiver gennem lydbehandling steder 1 og 3. Ødem er synlig ved position 1, men ikke sted 3.

Spektral analyse af optagne akustiske emissionsdata (Fig.5) kan vise harmonisk udstråling og / eller sub / ultra harmonisk udstråling, når stabil kavitation forekommende. HarmonICS kan også opstå fra væv ulineariteter, medens sub og ultraharmonic emissioner kun kan forekomme som et resultat af boble-aktivitet ^14. Ved højere tryk bredbåndssignaler emissioner angiver inerti kavitation kan også detekteres. Men disse er blevet forbundet med større mængder af røde blodlegemer ekstravasation og microdamage end sonications uden inertiel kavitation ^11.

Anvendelsen af ​​højere sonikering frekvenser resulterer i mere lokaliseret åbninger som følge af den mindre brændpunktet størrelse. Figur 6 viser, at højere frekvenser kan anvendes til at skabe små regioner åbning. Dette tillader undersøgelse af virkningerne midten af ​​hjernen med færre nær kranium virkninger.

Figur 1. Forsøgsopstillingen.

Figur 2. Pre (til venstre) og efter (højre) behandling T _1-w billeder af en rotte hjerne viser styrkelse på fire lydbehandling steder.

Figur 3. Pre (venstre) og efter (højre) behandling T _2-w billeder af en rottehjerne (samme dyr som fig. 2) viser T _2-w ødem ved sonikering steder. 1 og 2.

Figur 4. Efterbehandling sagittal _T1-w (venstre) og T _2-w (højre) billeder fra den samme rottehjerne som fig. 2 og 3. Åbningen i position 1 (venstre) korrelerer med T _2-w ødem (højre). Placering 3 viser åbning (venstre), men ingen T _2-w ødem.
Figur 5. Frekvensspektrum fra data fanges i løbet af en enkelt 10 ms burst på 551,5 kHz. Grundfrekvensen (f ₀₎ samt harmoniske (2 f ₀₎ og sub / ultraharmonics (0,5 f _0, 1,5 f ₀₎ er synlige.

Figur 6. Efterbehandling CE-T _1-w aksial (venstre) og sagittale (højre) billeder fra en rotte hjerne lydbehandledes i fire steder på 1,503 MHz. BBB åbninger ved denne frekvens ses at være mere lokaliseret.

Discussion

Forberedelse af dyrene og mikrobobler er de mest kritiske aspekter af denne procedure. Pelsen på dyrets hoved skal helt fjernes for at undgå formildende ultralydbølgen. BBB kan forstyrres under isofluoran bedøvelse, men det bliver sværere at opnå ensartet åbning.

Mikroboblerne bør altid håndteres med omhu og lille måler, skal store diameter nåle bruges ved udarbejdelse af, for at undgå at bryde dem. Tilsvarende bør den mindste gauge kateter, som med rimelighed kan anvendes i halevenen anvendes (22-gauge anbefales). Hvis en mindre kateter er nødvendig for at opnå korrekt placering i venen så ekstra pleje skal tages i løbet af mikrobobler injektionen. Mikroboble injektioner skal altid ske langsomt.

Burst-tilstand sonications bør altid anvendes. Hvis kontinuerlige bølge sonications anvendes mikroboblerne ikke genopbygge i karrene på transduceren fokus og BBBD ikke vil blive nået. Hvis CE-T _1-w billeder efter behandling ikke viser forstyrrelser, kan behandlingen gentages kontrollere, at vandniveauet er påfyldt, således at dyrene hovedet er i vandet, og at der ikke er nogen luftbobler er fanget på hudoverfladen .

Højere frekvenser giver bedre lokalisering i små dyremodeller, men kræver højere in situ tryk til at fremkalde åbning. Det er også vigtigt at overveje, at tab som følge af kraniet er højere ved højere tryk og skal tages i betragtning ved vurdering af in situ tryk. Ved 0,5 MHz transmission gennem rotte kraniet er ca 73% ^8, men falder til ca 50% ¹⁵ på 1,5 MHz. Dæmpning kan antages at være 5 Np m ^-1 MHz ^-1 i hjernevæv ^4. Højere frekvenser er bedre egnet til arbejde i små dyremodeller, men er mindre klinisk relevant.

telt "> Denne MRI-styrede fremgangsmåde giver fordele i forhold til ultralyd-styrede teknikker ved at tillade meget præcis målretning samt behandlingsresultater vurdering umiddelbart efter behandlingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Small Animal Focused Ultrasound System	FUS Instruments, Inc.	RK-100
Definity	Lantheus Medical Imaging
Omniscan	GE Healthcare