Summary
Microbellen-gemedieerde focused ultrasound verstoring van de bloed-hersen barrière (BBB) is een veelbelovende techniek voor niet-invasieve gerichte toediening van medicijnen in de hersenen
Abstract
Focused Ultrasound (FUS) verstoring van de bloed-hersen barrière (BBB) is een steeds onderzocht techniek voor het omzeilen van de BBB 1-5. De BBB is een belangrijke belemmering voor farmaceutische behandelingen van hersenaandoeningen zoals het beperkt de doorgang van moleculen uit de bloedvaten in het hersenweefsel om moleculen minder dan ongeveer 500 Da in maat 6. FUS geïnduceerde BBB verstoring (BBBD) is tijdelijk en omkeerbaar 4 en heeft een voordeel ten opzichte van chemische middelen voor het induceren van BBBD door zich zeer plaatselijk. FUS geïnduceerde BBBD een middel voor het onderzoeken van de effecten van een breed scala van therapeutische middelen op de hersenen, die anders niet zouden zijn leverbaar om het weefsel in voldoende concentratie. Hoewel een groot aantal ultrasone parameters bleken goed te verstoren de BBB 2,5,7, zijn er verschillende kritische stappen in de experimentele procedure voor succesvolle verstoring nauwkeurige targeting verzekeren. Dit protocolol wordt beschreven hoe u MRI-geleide FUS veroorzaakt BBBD in een ratmodel te bereiken, met een focus op de kritische dier voorbereiding en microbellen behandeling stappen van het experiment.
Protocol
1. Echografie en MRI-instelling
Een MRI-compatibele drie-assige focused ultrasound systeem werd gebruikt in dit onderzoek (FUS Instruments, Inc, Toronto, Ontario, Canada). Twee verschillende ultrasone transducenten werden gebruikt: een intern geconstrueerd 551,5 kHz bolvormige gerichte transducer (kromtestraal = 60 mm, een uitwendige diameter = 75 mm, een inwendige diameter 20 mm) en een 1,503 MHz, 8 sector array geïntegreerde PZT hydrofoon (Imasonic Inc, Voray-sur-L'Orgnon, Frankrijk) gereden als een enkel element sferisch gericht transducer (FN = 0,8, diafragma = 10 cm). Een MRI-compatibele PVDF ontvanger 8 werd gebruikt om akoestische emissies op te nemen wanneer de 551,5 kHz transducer werd gebruikt. Als er verschillende apparatuur wordt gebruikt, worden de volgende voorgesteld:
- Kies een geschikte, gekalibreerde ultrasone transducer met een centrale frequentie in het bereik van 0,25 MHz -1,5 MHz en een f-getal (kromtestraal / diafragma) van 1 of minder.
- Plaats een waterbad fidwz met warme, ontgast, gedeïoniseerd water op het bed van een 1,5 T of 3 T MRI. De waterbad moet een bovenplaat waarop steeds de dieren. Monteer de ultrasone transducer in de tank op een MRI-compatibele drie-assige positionering podium of systeem 9, met uitzicht op het wateroppervlak.
- Voer de transducer kabel aan op de echo rijden apparatuur door een penetratie paneel.
- Genereer de transducer rijden signaal met behulp van een functie-generator en eindversterker. Een externe matching circuit het gereflecteerde elektrische minimaliseren.
- Het kennen van de transducer brandpuntsafstand, plaats de transducer focus op het wateroppervlak en ultrasone trillingen het wateroppervlak om een zichtbare fontein te genereren. Stappen 1.6 en 1.7 wordt beschreven hoe u de focus met behulp van de gegenereerde fontein registreren. Een meer nauwkeurige methode voor het lokaliseren van de focus, waaraan bij sonicatie een warmteabsorberende gel en het afbeelden van het resulterende temperatuurverhoging in het brandpunt van MRI, vindt in 9 </ Sup>.
- Markeren de locatie van de focus met een markering die zichtbaar zijn op de MRI. Dit kan worden gedaan met behulp van een plaat met een gat in het midden, dat wordt met water gevuld bij plaatsing op de focus. De met water gevulde gat zichtbaar op de MRI en focal cooerdinaten in twee vlakken, terwijl de coördinaten in axiale richting van de omzetter kan worden bepaald uit het water.
- Een 3-vlak hartlijn sequentie beeld centraal marker en registreert de plaats van de focus van de MRI coördinatenstelsel.
- Akoestische emissie bewaken monteren een MR-compatibele hydrophone 8 die wordt gebruikt als een passieve cavitatie detector (PCD) in het waterbad gericht op de omzetter gericht, of met een opnemer met geïntegreerde hydrofoon.
- Voer de PCD-kabels om een scope-kaart die is voldoende snel om uitbarstingen van opname tot 10 ms bij HOI's tot 2 Hz (bijv. ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Canada). Kabels moeten worden geaard op de penetratie paneel of RF-schild om ruis te minimaliseren.
2. Toebereiding van dieren
- Verdoof de dieren met behulp van isofluorane gas. Aangezien isofluorane effect heeft op BBB verstoring 10 worden de dieren worden de gastoevoer 10 minuten voor het begin van het experiment. Place oculaire smeermiddel zalf in elk oog aan het begin van verdoving het hoornvlies beschermen tegen uitdrogen of andere schade.
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat scheren de vacht van de bovenkant van het hoofd van het dier en de nek, verwijder vervolgens de resterende vacht met behulp van een ontharingscrème (bijv. Nair, Church & Dwight Co, Princeton, NJ, USA) en spoel de hoofdhuid met een milde zeep en water.
- Bereid de staart met een betadine scrub de huid, gevolgd door een bridine wassen. Een laatste wipedown met alcohol om de staartader visualiseren.
- Plaats een 22 gauge katheter met 3-weg kraan in de staartader en spoel met een heparine / zoutoplossing mengsel (33 U / mL) om stolselvorming te voorkomenin de katheter.
- Lever injecteerbare anesthetica (40-50 mg / kg ketamine, 10 mg / kg xylazine) via intramusculaire injectie, en verwijder het dier uit de isofluorane.
- Plaats de verdoofde dier rug op de echo positionering systeem met de bovenkant van het hoofd contact opnemen met het waterbad door een gat in de top-plaat (figuur 1). Een kleine hoeveelheid ultrasound gel misschien toegepast op de bovenkant van de kop van het dier de kans opgesloten luchtbellen te minimaliseren.
- Tape de benen aan de positionering systeem. Het hoofd kan worden op zijn plaats gehouden met behulp van een hapje bar, indien beschikbaar, of tape geplaatst stevig over de kin.
- Bedek het dier met een handdoek en circulerende water deken om warm te houden.
3. Target Selection
Verwerven van baseline axiale T 2-gewogen en T 1-gewogen MR beelden van de hersenen. Bij gebruik van een 1,5 T MRI en toegewijde hoofd-en kleinbedrijf RF-ontvangst oppervlakte spoel, geschikt sceen parameters kunnen zijn:
T 2 gewogen: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
T 1 gewogen: FSE, TE = 10 ms, TR = 500 ms- Selecteer het doel van de T 2-gewogen scans, het vermijden van de ventrikels en de hersenen middellijn, en het selecteren van een mid-brain diepte.
- Verplaats de transducer focus naar de doellocatie.
4. Microbellen Voorbereiding
Definity microbellen (Lantheus Medical Imaging, MA, USA) worden gebruikt door verschillende groepen voor microbellen gemedieerde FUS veroorzaakt BBBD 2,5,7. Geschikte doseringen van andere microbelletjes types kunnen in de literatuur 11,12.
- Activeer de Definity microbellen en langzaam het opstellen van een klein volume in een 1 ml spuit met behulp van een 18-gauge naald.
- Verwijder de opgesloten lucht uit de spuit door voorzichtig het bewegen van de zuiger heen en weer. Tik niet op de spuit, want dit kan breken de bellen.
- Verdun de Definity in de normale zoutoplossing in een verhouding van 10:1 zoutoplossing Definty door langzaam injecteren van de benodigde hoeveelheid Definity in een spuit zoutoplossing. Als een infuus levering wordt gebruikt, kan de Definity verder verdund, tot 50:1 of 100:1.
- Voorzichtig omdraaien de spuit om zorgvuldig te worden gemengd Definity en zout tot een gelijkmatige uitstraling wordt bereikt. Gentle inversie van de spuit vlak voor de injectie kan ook nodig zijn wanneer de bellen zijn begonnen om uit te drijven van de opschorting.
- Bereken de vereiste dosis volume basis 0,02 ml / kg Definity of 0,2 ml / kg van de oplossing (bij 10:01 verdunning).
5. Echografie Levering
- Stel de sonicatie parameters, met behulp van een lage duty cycle uitbarstingen, niet continuous wave sonications. Geschikte parameters sonicatie 0,5 MHz 0.23 MPa in situ druk 10 ms bursts 1 Hz PRF, 2 min. totaal ultrasoonapparaat tijd. Bij 1,5 MHz passend in situ druk vallen om 0.45-0.5 MPa.
- Controleer het dier hoofd nog gekoppeld met het water.
- Injecteer langzaam de microbellen in de staartader katheter en spoel met 0,5 ml fysiologische zoutoplossing. Tegelijkertijd Begin de sonicatie met de start van de injectie.
6. MRI Evaluatie van de uitkomsten van behandeling
- Na de sonicatie, injecteren een MRI-contrastmiddel (bijv. 0,2 ml / kg Omniscan, GE Healthcare) via de staartader katheter, gevolgd door een 0,5 ml fysiologische zoutoplossing flush.
- Voer T 1-gewogen beeldvorming totdat het contrastmiddel piek voorbij is. Sonicatie sites die met succes zijn verstoord zal meer verbetering dan het omringende weefsel.
- Voer de T 2-gewogen beeldvorming om te controleren op oedeem. Hoge signaal op de sonicatie plaatsen is een indicatie van oedeem.
7. VertegenwoordigerResultaten
MRI contrastmiddelen met succes kan worden geleverd via de BBB met behulp van gerichte echografie en circulerende microbellen. Figuur 2 geeft kenmerkende voor en na FUS T 1-w beelden. Figuur 2B toont een verbeterd contrast (CE) T 1-w beeld met verschillende brandpunt openingen in vier gesoniceerd plaatsen. Sonicatie locaties 1 en 2 tonen in het bijzonder lichte verbetering. In Fig.3 plaatsen 1 en 2 blijkt ook dat overeenkomt met T 2 w hoog signaal te geven oedeem.
De mate van T2-w oedeem soms beter zichtbaar op sagittale segmenten. Figuur 4 toont CE-T 1-w en T2-w sagittale dwars door sonificatie plaatsen 1 en 3. Oedeem is zichtbaar op de locatie van 1 maar niet plaats 3.
Spectrale analyse van de gevangen genomen akoestische emissies gegevens (figuur 5) kan blijken harmonische emissies en / of sub / ultra harmonische emissies bij stabiele cavitatie optreedt. HarmonIC kunnen ontstaan weefsel niet-lineariteiten, terwijl sub en ultraharmonic emissie kan alleen plaatsvinden als gevolg van bel activiteit 14. Bij hogere druk breedband-uitstoot aangeeft inertiële cavitatie kan ook worden gedetecteerd. Maar deze zijn in verband gebracht met grotere hoeveelheden rode bloedcellen bloeduitstortingen en microschade dan sonications zonder inertie cavitatie 11.
Het gebruik van hogere frequenties sonificatie resulteert in meer gelokaliseerde openingen door de kleinere brandpunt grootte. Figuur 6 toont dat hogere frequenties kan worden kleinere gebieden opening te creëren. Dit maakt onderzoek van de effecten midden van de hersenen met minder bijna-schedel effecten.
Figuur 1. Experimentele opstelling.
Figuur 2. Pre (links) en na (rechts) behandeling T 1-w beelden van een rat brain met versterking op vier plaatsen sonicatie.
Figuur 3. Pre (links) en na (rechts) behandeling T 2 w beelden van een rat brain (zelfde dier Fig.2) met T 2 w oedeem bij sonificatie plaatsen 1 en 2.
Figuur 4. Nabehandeling sagittale T 1-w (links) en T-2 w (rechts) afbeeldingen van de rat als Fig. 2 en 3. De opening op locatie 1 (links) correleert met T 2 w oedeem (rechts). Plaats 3 toont opening (links) maar geen T 2 w oedeem. 
Figuur 5. Frequentie spectrum van gegevens die zijn vastgelegd tijdens een 10 ms burst op 551,5 kHz. De fundamentele frequentie (f 0) en harmonischen (2 f 0) en sub / ultraharmonics (0,5 f 0, 1,5 f 0) zichtbaar.
Figuur 6. Na de behandeling CE-T 1-w axiale (links) en sagittale (rechts) beelden van een rat hersenen gesoniceerd op vier locaties op 1.503 MHz. BBB openingen op deze frequentie worden beschouwd te zijn gelokaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voorbereiding van de dieren en microbellen zijn de meest kritische aspecten van deze procedure. Het haar op het hoofd van het dier moet in zijn geheel worden verwijderd om te voorkomen dat verzachtende het ultrasone geluid. De BBB kan worden verstoord onder isofluorane verdoving, echter, wordt het moeilijker om consistente opening.
De microbolletjes altijd worden omgegaan en kleine overdruk moet grote diameter naalden worden bij het opstellen, om te voorkomen breken. Ook moet de kleinste gauge katheter redelijkerwijs kan worden gebruikt in de staartader worden gebruikt (22-gauge aanbevolen). Als er een kleinere katheter nodig is om een juiste plaatsing in de ader te bereiken dan extra zorg moeten worden genomen tijdens de microbellen injectie. De microbellen injecties moet altijd langzaam gebeuren.
Burst-modus sonications moet altijd worden gebruikt. Als continue sonications worden gebruikt de microbellen zal niet vullen in de schepen op de transducer focus en BBBD zal niet worden bereikt. Als CE-T 1-w foto's na de behandeling niet blijkt verstoring, kan de behandeling worden herhaald controleren of het waterniveau wordt bijgevuld, zodat op dat de dieren hoofd in het water en dat er geen luchtbellen ingesloten op het huidoppervlak .
Hogere frequenties betere lokalisatie in kleine diermodellen maar een hogere druk in situ te openen induceren. Het is ook belangrijk om te overwegen dat de verliezen als gevolg van de schedel zijn hoger bij hogere druk en moet rekening houden bij het schatten van in situ druk. 0,5 MHz transmissie via rat schedel ongeveer 73% 8, maar daalt tot ongeveer 50% 15 1,5 MHz. Demping kan worden aangenomen tot 5 Np m -1 MHz -1 in het hersenweefsel 4. Hogere frequenties zijn beter geschikt voor in kleine diermodellen maar minder klinisch relevant.
tent "> Deze MRI-geleide aanpak biedt voordelen ten opzichte van echogeleide technieken, doordat heel precies richten en resultaat van de behandeling evaluatie direct na de behandeling.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K. Hynynen en R. Chopra zijn mede-oprichters van FUS Instruments, Inc R. Chopra, A. Waspe en K. Hynynen zijn aandeelhouders van FUS Instruments, Inc K. Hynynen krijgt ondersteuning voor onderzoek van FUS instrumenten, Inc
Acknowledgments
De auteurs willen graag Shawna Rideout-Gros en Alexandra Garces bedanken voor hun hulp bij de verzorging van dieren, en Ping Wu voor haar technische bijstand. Ondersteuning voor dit werk werd verstrekt door de National Institutes of Health in subsidie niet. EB003268, en de Canada Research Chairs Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Animal Focused Ultrasound System | FUS Instruments, Inc. | RK-100 | |
| Definity | Lantheus Medical Imaging | ||
| Omniscan | GE Healthcare |
References
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11719-11723 (2006).
- Jordão, J. F., Ayala-Grosso, C. A., Markham, K., Huang, Y., Chopra, R., McLaurin, J., Hynynen, K., Aubert, I. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 5 (5), e10549-e10549 (2010).
- Liu, H. -L., Hua, M. -Y., Chen, P. -Y., Chu, P. -C., Pan, C. -H., Yang, H. -W., Huang, C. -Y., Wang, J. -J., Yen, T. -C., Wei, K. -C. Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment. Radiology. 255, 415-425 (2010).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Choi, J. J., Wang, S., Tung, Y. -S., Morrison, B., Konofagou, E. E. Molecules of various pharmacologically-relevant sizes can cross the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in vivo. Ultrasound Med. Biol. 36, 58-67 (2010).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound Med. Biol. 35, 1298-1308 (2009).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. A PVDF receiver for ultrasound monitoring of transcranial focused ultrasound therapy. IEEE Trans. Biomed. Eng. 57, 2286-2294 (2010).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Med. Phys. 36, 1867-1874 (2009).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-Brain Barrier Disruption and Vascular Damage Induced by Ultrasound Bursts Combined with Microbubbles can be Influenced by Choice of Anesthesia Protocol. Ultrasound Med. Biol. , (2011).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Yang, F. -Y., Liu, S. -H., Ho, F. -M., Chang, C. -H. Effect of ultrasound contrast agent dose on the duration of focused-ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. J. Acoust. Soc. Am. 126, 3344-3349 (2009).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med. Biol. 34, 834-840 (2008).
- Neppiras, E. A. Acoustic Cavitation. Physics Reports (Review Section of Physics Letters). 61, 159-251 (1980).
- O'Reilly, M. A., Huang, Y., Hynynen, K. The impact of standing wave effects on transcranial focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier in a rat model. Phys. Med. Biol. 55, 5251-5267 (2010).
