Summary
Kan-beyin bariyeri (KBB) ve Mikro-aracılı odaklanmış ultrason bozulması beyinde non-invaziv hedeflenen ilaç dağıtımı için umut verici bir tekniktir
Abstract
Kan-beyin bariyeri (KBB) odaklanmış ultrasonu (FUS) bozulması BBB 1-5 engellemeyi için giderek incelenmiştir tekniktir. Daha az boyutu 6 yaklaşık 500 Da fazla molekül ile beyin doku içine vaskülatürün gelen moleküllerin geçişini sınırlar olarak bbb beyin bozukluklarının tedavisi için farmasötik önemli bir engel teşkil etmektedir. FUS bağlı BBB bozulması (BBBD) kimyasal bir avantajı yüksek oranda lokalize olmakla BBBD indüklenmesi anlamına gelir geçici ve 4 reversibl olup sahiptir. FUS endüklenen BBBD aksi yeterli bir konsantrasyonda dokuya teslim olmaz beyin, ilgili terapötik ajanları çok çeşitli etkisini araştırmak için bir araç sağlar. Ultrason parametreleri geniş bir yelpazede BBB 2,5,7 bozarak başarılı kanıtlanmış ise de, hassas hedefleme ile başarılı ayrılmasını sağlamak üzere deneysel prosedür birkaç önemli adımlar vardır. Bu protocol özetliyor nasıl kritik hayvan hazırlık ve deneme mikrokabarcık işleme adımları odaklanarak, sıçan modelinde BBBD oluşturulan MR güdümlü FUS ulaşmak için.
Protocol
1. Ultrason ve MR Kurulum
Bir MR-uyumlu üç eksenli odaklanmış ultrason sistemi (FUS Instruments, Inc, Toronto, Ontario, Kanada) bu çalışmada kullanılmıştır. İki farklı ultrason dönüştürücüler kullanılmıştır: entegre bir ev inşa 551,5 kHz küresel odaklı dönüştürücü (eğrilik yarıçapı = 60 mm, dış çapı = 75 mm, iç çapı = 20 mm) ve 1.503 MHz, 8-dizi sektörü PZT hidrofon (Imasonic A.Ş., Voray-sur-L'Orgnon, Fransa) tek bir eleman küresel odaklı dönüştürücü (= 0.8, diyafram = 10 cm FN) olarak sürülür. Bir MR-uyumlu PVDF alıcı 8 551,5 kHz transdüktör kullanılan edildiğinde akustik emisyon kaydetmek için kullanıldı. Farklı donanım kullanılması durumunda, aşağıdaki önerilmiştir:
- 0,25 MHz -1.5 MHz merkez frekansı ve 1 veya daha az bir f-sayı (eğrilik / diyafram yarıçapı) ile uygun, kalibre ultrason probu seçin.
- Bir su banyosu fi yerleştirin1.5 T veya 3 T MR yatakta sıcak, vakum gazından arındırılmış, de-iyonize su ile lled. Su banyosu hayvanları tutabilecek bir üst plaka olmalıdır. Su yüzeyine bakacak şekilde, bir MRI uyumlu üç eksenli konumlandırma aşamasında veya sistem 9 tankında ultrason probu monte edin.
- Bir penetrasyon paneli üzerinden ultrason sürüş donanımları için dönüştürücü kablo çalıştırın.
- Bir fonksiyon jeneratör ve güç amplifikatör kullanarak dönüştürücü sürüş sinyal üretir. Yansıyan elektrik gücü en aza indirmek için harici bir eşleştirme devre kullanın.
- Transdüser odak uzaklığı bilerek, su yüzeyinde dönüştürücü odağı yerleştirin ve görünür bir su çeşme oluşturmak için su yüzeyine ses dalgalarına maruz. Adımlar 1.6 ve 1.7 oluşturulan su çeşme kullanarak odağı kayıt nasıl açıklar. MRG ile odak jel ve görüntüleme çıkan sıcaklık artışı emici bir ısı sonicating içerir odak, yerini daha kesin bir yöntem, 9 bulunabilir </> Sup.
- MR görüntüleri görünür olacak bir kalem kullanarak odak konumu işaretleyin. Bu odak içinde yerleştirildiği zaman su ile doldurur bir merkezi deliğe sahip bir plaka kullanılarak yapılabilir. Transdüktörün eksenel yönde koordinat su yüzeyine tespit edilebilir ise su dolu deliği, MRI görünür olacak ve iki düzlemde fokal koordinatları sağlayacaktır.
- , Bir 3-düzlem yerelleştiricisinin dizisi kullanılarak görüntü odak işaretleyici ve MRI koordinat sisteminde odak konumu kaydeder.
- Akustik emisyon izlemek için dönüştürücü odak yönelik su banyosunda pasif bir kavitasyon dedektörü (PCD) olarak kullanılan bir MR-uyumlu hidrofon 8 bağlamak, ya da entegre hidrofon bir dönüştürücü kullanın.
- 2 Hz (örneğin ATS460, AlazarTech, Pointe-Claire, Quebec, Kanada) PRFs az 10 ms kadar patlamaları kadar yakalamak için yeterince hızlı olan bir kapsam kartına PCD kabloları çalıştırın. Kablolar pene için topraklanmalıdırtration panel veya RF kalkan gürültüyü en aza indirmek için.
2. Hayvan Hazırlık
- Isofluorane gaz kullanarak hayvanları uyuşturmak. Bbb isofluorane bozulması 10 üzerinde bir etkiye sahip olduğu için, hayvan deney başlamadan önce gaz 10 dakika kapalı alınmalıdır. Kuruma veya diğer yaralanma korneayı korumak için anestezi başlangıcında her bir gözü de göz yağlayıcı pomad.
- Bir elektrik ustura kullanarak hayvanın baş ve boyun üst kürk tıraş, sonra bir tüy dökücü krem (örneğin Nair, Church & Dwight Co, Princeton, NJ, ABD) kullanılarak kalan kürk kaldırmak ve sabunla yıkayın ve kafa derisi su.
- Bir bridine yıkama tarafından izlenen bir betadin deri fırçalayın ile kuyruk hazırlayın. Kuyruk veni görselleştirmek için alkol ile son wipedown gerçekleştirin.
- Kuyruk damara 3-yollu bir 22 gauge kateter takma ve pıhtı oluşumunu engellemek için heparin / tuzlu su karışımı (33 U / ml) ile yıkayınkateter.
- Intramüsküler enjeksiyon yoluyla enjektabl anestezik (40-50 mg / kg ketamin, 10 mg / kg xylazine) teslim ve isofluorane gelen hayvan çıkarın.
- Üst plaka (Şekil 1) bir delikten su banyosunda temas başın üst ultrason konumlandırma sistemi üzerinde anestezi hayvan sırtüstü yerleştirin. Ultrason küçük bir miktarı belki sıkışıp airbubbles olasılığını en aza indirmek için hayvanın kafanın üst uygulanan jel.
- Konumlandırma sistemi Teyp bacaklar. Kafası Ya bir lokma çubuğunu kullanarak yerinde tutulur, varsa, veya bant çene boyunca sıkıca yerleştirilmiş olabilir.
- Bir havlu ve sıcak tutmak için su battaniye dolaşımdaki hayvan örtün.
3. Hedef Seçimi
Bazal eksenel T beynin 2-ağırlıklı ve T 1 ağırlıklı MR görüntüleri elde edin. 1.5 T sc uygun, kafa ölçekli RF-alma yüzeyi bobin MRI ve özel kullanıyorsanızbir parametre olabilir:
T 2 ağırlıklı: FSE, TE = 60 ms, TR = 2000 ms
Ağırlıklı T 1: FSE, TE = 10 ms, TC = 500 ms- T hedef seçin 2-ağırlıklı taramalar, ventriküller ve beyin orta hat kaçınarak, ve bir orta beyin derinliğini seçebilmek.
- Hedef konuma dönüştürücü odağı taşıyın.
4. Mikro Hazırlık
Definity mikro kabarcıklar (Lantheus Tıbbi Görüntüleme, MA, ABD) BBBD 2,5,7 uyarılan mikrokabarcık aracılı FUS için çeşitli gruplar tarafından kullanılmaktadır. Diğer mikrokabarcık türleri için uygun bir dozaj literatürde 11,12 bulunabilir.
- Definity mikro kabarcıklar etkinleştirin ve yavaş yavaş 18-gauge iğne ile bir 1 ml şırınganın içine küçük bir hacme kadar çizin.
- Yavaşça ileri geri hareket ettirerek piston enjektör sıkışmış havayı çıkarın. Bu kabarcıkları gibi şırınga vurmayın.
- Normal olarak Definity seyreltilir tuzlu su yavaş yavaş bir şırıngaya Definity gerekli hacmi enjekte etmek Definty 10:01 salin oranında bir tuzlu su. Bir infüzyon iletim kullanıldığında, Definity 50:1 veya 100:1 'e kadar, daha da seyreltilmiş olabilir.
- Hafifçe daha da görünüm elde edilinceye kadar iyice Definity ve tuzlu karıştırmak için şırıngayı ters çevirin. Baloncuklar süspansiyon akıp başlamıştır derhal enjeksiyondan önce şırınganın Nazik inversiyon da gerekli olabilir.
- 0,02 mL / kg Definity, veya 0,2 mL / kg çözeltisi (10:01 seyreltme) göre gerekli doz birimi hesaplamak.
5.. Ultrason Teslimat
- Düşük görev döngüsü patlamaları değil, sürekli dalga sonications kullanarak, sonication parametreleri ayarlayın. 0.5 MHz'de Uygun sonication parametreleri yerinde basıncı 0.23 MPa, 1 Hz PRF, 2 dakika 10 ms patlamaları vardır. toplam sonication zaman. In situ baskılara uygun 1,5 MHz 0,45-0,5 Mpa civarında düşecek.
- Canlının kafası hala su birleştiğinde olduğundan emin olun.
- Kuyruk damarından kateter yavaşça kabarcıkların enjekte edilir ve 0.5 ml serum fizyolojik ile yıkayın. Enjeksiyon başlaması ile eş zamanlı sonikasyon başlayın.
6. Tedavisinin MRG Değerlendirilmesi
- Sonikasyon ardından, 0.5 ml serum fizyolojik floş ardından kuyruk damarından kateter yoluyla (örneğin 0.2 ml / kg Omniscan, GE Healthcare) bir MR kontrast madde enjekte edilir.
- Buna zirve geçti kadar T 1 ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirin. Başarılı bir şekilde bozulmuştur Sonikasyon siteleri çevre dokulara daha fazla geliştirme gösterecektir.
- Ödemi kontrol etmek için T 2 ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirin. Sonikasyon sitelerinde Yüksek sinyal ödem göstergesidir.
7. TemsilciSonuçlar
MR kontrast ajanlar başarıyla odaklı ultrason kullanılarak ve kabarcıkların dolaşan BBB ile teslim edilebilir. Şekil 2 tipik öncesi ve sonrası FUS T 1-w görüntüleri gösterir. Şekil 2B bir kontrastlı (CE) T 1-w dört sonike yerlerde farklı odak açıklıklar ile görüntü gösterir. Sonikasyon 1 ve 2, özellikle parlak kontrastlanma gösterirler. Şekil 3 konumlarda 1 ve 2 de ödemi gösteren T 2-w yüksek sinyali ile haberleşmek için görülebilir.
T ölçüde 2-w ödem bazen sagital dilimleri daha kolay görüntülenebilmekte. Şekil 4 CE-T 1-w ve T 2-w sajital dilimleri sonikasyon yerleri vasıtasıyla 1 ve 3 gösterir. Ödem konumu 1 değil 3 yerde de görülebilir.
Yakalanan akustik emisyon verileri (Şekil 5) spektral analizi harmonik emisyonlar ve / veya stabil kavitasyon oluşmasını ultra / alt harmonik emisyonlar gösterebilir. Harmonalt ve ultraharmonic emisyonu sadece kabarcık etkinliği 14 bir sonucu olarak oluşabilir ederken ics Ayrıca, doku linearitenin ortaya çıkabilir. Yüksek basınçlarda eylemsizlik kavitasyon gösteren geniş bant emisyonları da tespit edilebilir. Ancak bu eylemsizlik kavitasyon 11 olmadan sonications fazla kırmızı kan hücresi ekstravazasyonlar ve microdamage büyük miktarlarda ile ilişkili bulunmuştur.
Küçük fokal spot boyutu nedeniyle daha yerel açıklıklar yüksek sonikasyon frekansları sonuçlarının kullanımı. Şekil 6 daha yüksek frekanslar açıklığın küçük bölgeler oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu, daha az yakın kafatası etkileri olan etkileri orta beyin soruşturma sağlar.
Şekil 1. Deneysel kurulum.
Şekil 2. Ön (sol) ve sonrası (sağ) tedavisi T 1-w dört sonikasyon yerlerde iyileştirme gösteren bir sıçan beyin görüntüleri.
Şekil 3. Ön (sol) ve sonrası (sağ) tedavisi T 2-w T sonikasyon 1 ve 2 de 2-w ödem gösteren bir sıçan beyin (Şekil.2 aynı hayvan) görüntüleri.
Şekil 4. Tedavi sonrası sagital T 1-w (sol) ve T 2-w (sağ) aynı sıçan beyninden görüntü olarak Şek. 2 ve 3. Konumu 1 açılış (solda) T 2-w ödem (sağda) ile ilişkilidir. Yer 3 açılış (solda) ancak T 2-w ödemi. 
Şekil 5. 551,5 kHz tek bir 10 ms patlama sırasında yakalanan verileri Frekans spektrumu. Temel frekans (f 0) yanı sıra, harmonik (2 f 0) ve alt / ultraharmonics (0,5 f 0, 1,5 f 0) görülebilir.
Şekil 6. Tedavi sonrası CE-T 1-w aksiyel (sol) ve 1.503 MHz dört yerlerde sonicated bir sıçan beyin sagital (sağda) görüntüler. Bu frekansta BBB açıklıklar daha fazla lokalize olduğu görülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hayvan ve mikro kabarcık hazırlanması, bu prosedürün en kritik yönleri vardır. Hayvanın kafasına saç tamamen ultrason ışın zayıflattığı önlemek için kaldırılmalıdır. BBB isofluorane anestezi altında bozulabilir, ancak tutarlı açılış ulaşmak için daha zor olur.
Bunları kırma önlemek için, yukarı çizerken kabarcıkların zaman bakım ve küçük ölçü ele alınmalıdır, büyük çaplı iğneler kullanılmalıdır. Benzer şekilde, mantıklı kuyruk damarından kullanılabilir küçük ölçer kateter (22 çap önerilir) kullanılmalıdır. Daha küçük bir kateter ven doğru yerleşmesini sağlamak için gerekirse daha sonra ekstra bakım mikro-enjeksiyon sırasında alınmalıdır. Mikro-enjeksiyon her zaman yavaş yavaş yapılmalıdır.
Burst modu sonications her zaman kullanılmalıdır. Sürekli dalga sonications kullanılırsa kabarcıkların doldurmak değil içine dönüştürücü odak ve BBBD, gemilerin sağlanamaz. CE-T 1-w görüntüleri tedavi sonrası kesinti göstermek yoksa, arıtma su seviyesinin hayvanların baş deri yüzeyinde sıkışmış hava kabarcıkları vardır suda ve böylece tepesinde olduğunu kontrol tekrar edilebilir .
Yüksek frekanslar küçük hayvan modellerinde daha iyi yerelleştirme sağlar, ancak açılış teşvik için yerinde baskılar daha yüksek gerektirir. Kafatası kaynaklanan kayıpların daha yüksek basınçta daha yüksek ve yerinde basınçları tahmin edilirken dikkate alınması gerektiğini dikkate almak da önemlidir. Sıçan kafatası ile 0.5 MHz iletim yaklaşık% 73 8, ama 1.5 MHz hızında yaklaşık 50% 15 düşer. Zayıflama beyin dokusunda 4 5 Np m -1 MHz -1 olarak kabul edilebilir. Yüksek frekansları daha küçük hayvan modellerinde iş için uygundur ancak daha az klinik olarak uygulanır.
çadır "> Bu MR güdümlü yaklaşım derhal tedavi sonrası hedef yanı sıra tedavi sonuçlarını değerlendirme çok hassas izin vererek ultrason rehberliğinde teknikleri üzerinde avantajlar sağlamaktadır.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
K. Hynynen ve R. Chopra FUS Araçların kurucuları, Inc R. Chopra, A. ve K. Waspe Hynynen hissedarlar FUS Aletleri, Inc K. Hynynen FUS aletleri, Inc araştırma desteği alan
Acknowledgments
Yazarlar, hayvan bakımı ile yardım için Shawna Rideout-Gros ve Alexandra Garces teşekkür ve onun teknik yardım için Wu Ping olacaktır. Bu iş için hibe desteği hiçbir altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından sağlandı. EB003268 ve Kanada Araştırma Sandalyeler Programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Animal Focused Ultrasound System | FUS Instruments, Inc. | RK-100 | |
| Definity | Lantheus Medical Imaging | ||
| Omniscan | GE Healthcare |
References
- Kinoshita, M., McDannold, N., Jolesz, F. A., Hynynen, K. Noninvasive localized delivery of Herceptin to the mouse brain by MRI-guided focused ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11719-11723 (2006).
- Jordão, J. F., Ayala-Grosso, C. A., Markham, K., Huang, Y., Chopra, R., McLaurin, J., Hynynen, K., Aubert, I. Antibodies targeted to the brain with image-guided focused ultrasound reduces amyloid-beta plaque load in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. PLoS One. 5 (5), e10549-e10549 (2010).
- Liu, H. -L., Hua, M. -Y., Chen, P. -Y., Chu, P. -C., Pan, C. -H., Yang, H. -W., Huang, C. -Y., Wang, J. -J., Yen, T. -C., Wei, K. -C. Blood-brain barrier disruption with focused ultrasound enhances delivery of chemotherapeutic drugs for glioblastoma treatment. Radiology. 255, 415-425 (2010).
- Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
- Choi, J. J., Wang, S., Tung, Y. -S., Morrison, B., Konofagou, E. E. Molecules of various pharmacologically-relevant sizes can cross the ultrasound-induced blood-brain barrier opening in vivo. Ultrasound Med. Biol. 36, 58-67 (2010).
- Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2, 3-14 (2005).
- Bing, K. F., Howles, G. P., Qi, Y., Palmeri, M. L., Nightingale, K. R. Blood-brain barrier (BBB) disruption using a diagnostic ultrasound scanner and Definity in mice. Ultrasound Med. Biol. 35, 1298-1308 (2009).
- O'Reilly, M. A., Hynynen, K. A PVDF receiver for ultrasound monitoring of transcranial focused ultrasound therapy. IEEE Trans. Biomed. Eng. 57, 2286-2294 (2010).
- Chopra, R., Curiel, L., Staruch, R., Morrison, L., Hynynen, K. An MRI-compatible system for focused ultrasound experiments in small animal models. Med. Phys. 36, 1867-1874 (2009).
- McDannold, N., Zhang, Y., Vykhodtseva, N. Blood-Brain Barrier Disruption and Vascular Damage Induced by Ultrasound Bursts Combined with Microbubbles can be Influenced by Choice of Anesthesia Protocol. Ultrasound Med. Biol. , (2011).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity. Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).
- Yang, F. -Y., Liu, S. -H., Ho, F. -M., Chang, C. -H. Effect of ultrasound contrast agent dose on the duration of focused-ultrasound-induced blood-brain barrier disruption. J. Acoust. Soc. Am. 126, 3344-3349 (2009).
- McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. Blood-brain barrier disruption induced by focused ultrasound and circulating preformed microbubbles appears to be characterized by the mechanical index. Ultrasound Med. Biol. 34, 834-840 (2008).
- Neppiras, E. A. Acoustic Cavitation. Physics Reports (Review Section of Physics Letters). 61, 159-251 (1980).
- O'Reilly, M. A., Huang, Y., Hynynen, K. The impact of standing wave effects on transcranial focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier in a rat model. Phys. Med. Biol. 55, 5251-5267 (2010).
