Un método de utilización de estado sólido nanoporos para controlar la adsorción inespecífica de proteínas en una superficie inorgánica se describe. El método emplea el principio de resistencia de pulso, lo que permite la absorción que se probaron en tiempo real y en el nivel de moléculas individuales. Debido a que el proceso de adsorción sola proteína está lejos del equilibrio, se propone el empleo de arrays paralelos de nanoporos sintéticos, lo que para la determinación cuantitativa de la velocidad de reacción aparente de primer orden constante de adsorción de proteínas, así como la constante de Langmuir de adsorción.
De estado sólido nanoporos se han utilizado para realizar mediciones en el nivel de moléculas individuales para examinar la estructura local y la flexibilidad de los ácidos nucleicos 1-6, el despliegue de las proteínas de 7, y la afinidad de unión de diferentes ligandos 8. Mediante el acoplamiento de estos nanoporos para la técnica de resistencia de pulso 9-12, estas mediciones se puede hacer en una amplia variedad de condiciones y sin necesidad de etiquetado 3. En la técnica de resistencia de pulso, una solución de sal iónica se presenta en ambos lados de la nanopore. Por lo tanto, los iones son expulsados de un lado de la cámara a la otra por un potencial de membrana aplicada, dando lugar a una corriente constante. La partición de un analito en el nanopore causa una deflexión bien definidas en esta corriente, que pueden ser analizados para extraer una sola molécula de la información. Usando esta técnica, la adsorción de proteínas individuales a las paredes nanopore puede ser monitoreado en una amplia gama decondiciones 13. Adsorción de proteínas está creciendo en importancia, ya que como dispositivos de microfluidos disminuye de tamaño, la interacción de estos sistemas con proteínas individuales se convierte en una preocupación. Este protocolo describe un ensayo rápido para la proteína de unión a las películas de nitruro, que puede extenderse fácilmente a otras películas delgadas susceptibles a la perforación nanopore, ni a las superficies de nitruro de funcionalizado. Una gran variedad de proteínas puede ser explorado en una amplia gama de soluciones y las condiciones de desnaturalización. Además, este protocolo podrá ser utilizado para explorar problemas más básicos de uso de la espectroscopia nanopore.
Espontánea de adsorción de las proteínas en estado sólido de superficies 27-29 es de fundamental importancia en una serie de áreas, como las aplicaciones biochip y el diseño de una nueva clase de biomateriales híbridos funcionales. Estudios previos han demostrado que las proteínas adsorbidas a las superficies de estado sólido no muestran la movilidad lateral o tasas significativas de desorción, y por lo tanto la adsorción de proteínas generalmente se considera un proceso irreversible y no específ…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a John Grazul (Cornell University), Marziali Andre (de la Universidad de British Columbia en Vancouver) y Vincent Tabard-Cossa (de la Universidad de Ottawa) por su asesoramiento. Este trabajo está financiado en parte por subvenciones de los EE.UU. National Science Foundation (DMR-0706517 y 1006332-DMR) y los Institutos Nacionales de Salud (R01-GM088403). La perforación nanopore se realizó en el Servicio de Microscopía Electrónica del Centro de Cornell para la Investigación de Materiales (CCAM), con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias – Ciencias de los Materiales de Investigación y Centros de Ingeniería (MRSEC) programa (DMR 0520404). La preparación de las membranas de nitruro de silicio se llevó a cabo en el Centro de Cornell nanoescala, un miembro de la Red de Nanotecnología Nacional de Infraestructura, que es apoyada por la National Science Foundation (Grant ECS-0335765).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tecnai F20 S/TEM | FEI | S/TEM requires acceleration voltage ≥200kV and field-emission source. | |
20 nm thick silicon nitride membrane window for TEM | SPI | 4163SN-BA | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Axon Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pCLAMP 10 software | Molecular Devices | Electrophysiology Data Acquisition and Analysis Software | |
Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A300 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
silicone O-rings | McMaster-Carr | 003 S70 | Alternatively use PDMS |
silver wire | Sigma-Aldrich | 348759 | For electrodes |
SPC Technology, D sub contact, pin | Newark | 9K4978 | For electrodes |
potassium chloride | Sigma | P9541 | |
potassium phosphate dibasic | Sigma | P2222 | |
potassium phosphate monobasic | Sigma | P5379 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgar 184 Elastomer set. For making chamber. | |
Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Fast acting silicone sealant |
hot plate | Fisher Scientific | ||
Faraday cage |