1. Forbered Fixativ (Se tabel fiksativ og buffere). 2. Forbered perfusion Buffere (Se tabel fiksativ og buffere). 3. Forbered Apparatur og bedøvelse Ved hjælp af vandbad varmt perfusionsbuffer til 37 ° C. Sted udløbsventil i et bægerglas fyldt med puffer. Fyld en 50 ml sprøjte med buffer og tillægger fiksativ slange. Skylle slangen gange ved at udstøde og tilbagetrækning puffer. Ryd linje med buffer, indtil alle luftbobler i slangen er elimineret. Det er afgørende for succesen af en perfusion ikke at have luftbobler i nogen af linjerne. Fjern sprøjten, og tilslut 4% paraformaldehyd fiksativ (stuetemperatur) beholder. For at undgå luftbobler i røret ende klemme røret, mens anbringelse af røret ind i beholderen, således at en dråbe buffer rager frem fra enden tO-kontakten væskeoverfladen inden i beholderen. Lukke udgangsporten (nåleenden). Drej buffer ventil (blå) til den samme position som fiksativ ventil (hvid). Dette vil tillade strømning fra bufferen linje. Åbne udløbsåbningen, og gentag trin A1 gennem A3 til fyldning bufferen linje. Efter at alle de luftbobler fjernes tæt udløbsporten, fjernes sprøjten og forbinde pufferen beholderen, idet man ikke at indføre luftbobler i slangerne. Testsystem til evnen til at holde tryk ved pumpning gummi manometer Blub. Der normalt er en vis modstand på grund af kompression af luft i systemet. Opsætning kirurgi værktøjer, for nem adgang. Fylde perfusion nål med puffer for at eliminere muligheden for luftbobler. Før kirurgi, er en ketamin / xylazin-blanding (op til 80 mg / kg legemsvægt ketamin og 10 mg / kg legemsvægt xylazin) indgives via intraperitoneal injektion (27 gauge nål og en cc sprøjte). Yderligere indgivelse af anæstetikum udføres om nødvendigt i løbet af hver operation til at opretholde en kirurgisk plan af anæstesi. 4. Perfusion Kirurgi Når dyret har nået en kirurgisk plan anæstesi, placere den på den lave bakke fyldt med knust is. (Brug toe knivspids-respons-metoden til at bestemme dybden af bedøvelse. Dyret skal reagerer, før du fortsætter). Lav en 5-6 cm lateral snit gennem integument og bugvæggen lige under brystkassen. Omhyggeligt adskille leveren fra membranen. Lave et lille snit i membranen ved hjælp af de krumme og stumpe saks. Position og trykket af fingeren kan hjælpe i evnen til at skære membranen. Fortsætte membranen snit langs hele længden af ribben bur for at blotlægge det pleurale hulrum. Placer buede, sløve saks langs den ene side af ribberne, omhyggeligt fortrænge lungerne, og lave en cut gennem brystkassen op til kravebenet. Foretage en tilsvarende snit på den kontralaterale side. Løft brystbenet væk, omhyggeligt trimme alle væv at tilslutte den til hjertet. Fastspænde brystbensspids med arterieklemme og placere hæmostat over hovedet. Når du er færdig korrekt, thymus løfter væk fra hjertet sammen med brystbenet, giver et klart billede af de store fartøjer. Lave et lille snit i den bageste ende af den venstre ventrikel ved anvendelse af iris saks. Klik her for at se større figur . Passerer en 15-gauge stump-eller olivenolie spids perfusion nål gennem snittet ventrikel ind i aorta ascendens. Spidsen skal være synligt gennem væggen i aorta, og bør ikke være aortabuen hvor brachial og carotide arterier divergerer. Anvender en hæmostat at fastklemme hjertet dette sikrer nålen og forhindrer lækage. Hvis det ønskes, kan det modificerede hæmostat anvendes til at klemme aorta omkring nålens spids (disse hemostats forbliver på plads, indtil dissektion begynder, men er udeladt fra fremtidige illustrationer af hensyn til overskueligheden). Endelig lave et snit i dyrets højre atrium med iris saks til at skabe så stort et udløb som muligt uden at beskadige den nedadgående aorta. På dette tidspunkt dyret er parat til at blive perfunderet. 5. Perfusion Åbn og vedhæfte udgangsporten til p basen pas på ikke at indføre eventuelle luftbobler. Skru op for manometeret pære til et tryk på 80 mm Hg hurtigt og jævnt. Opretholde dette tryk i hele bufferen infusionsperioden. Start timeren. Juster nålen vinkel. Vinklen af nålen er afgørende for opnåelse af en maksimal flowhastighed (bemærk flow ændringen med vinkel justering). Skift buffER ventil (blå), når bufferen er næsten afsluttet (200 ml). Fluidet skal køre klar. Udligningen af leveren er en indikator for en god perfusion. Leveren bør være klart på dette tidspunkt. Angiv tid til dine optegnelser. Fiksering rystelser skal overholdes inden for få sekunder, skal dette betragtes som sande tidspunkt for fiksering. Angiv tid til dine optegnelser. Trykket kan efterhånden være stige op til et maksimum på 130 mm Hg 2 for at opretholde en lind strøm på. Lukke udløbsventilen når fiksativet er næsten færdig. Angiv sluttid for dine optegnelser. Rotten skal være stiv på dette tidspunkt. Den anvendte paraformaldehyd skal opsamles og opbevares til bortskaffelse i henhold til reglerne i din institution. 6. Dissektion 4,11 Tag hovedet med en saks. Gøre en midtlinie-incision langs integument fra halsen til næsen og blotlæggekraniet. Skær de resterende halsmusklerne, så bunden af kraniet udsættes; fjerne enhver resterende muskler ved hjælp af saks eller rongeurs. Anbring den skarpe ende af et par iris sakse i foramen magnum på den ene side, forsigtigt at glide saksen langs den indre overflade af skallen. Dernæst lave et snit strækker sig til den distale kant af den bageste kraniet overflade. Foretage en identisk snit på den kontralaterale side. Brug rongeurs for at fjerne kraniet omkring lillehjernen. Omhyggeligt glide saksen langs den indre overflade af kraniet, som spidsen bevæger sig fra den dorsale distale bageste hjørne til den distale forreste kant af skallen, løfter på bladet, som man skærer at forhindre skade på hjernen. Gentag til modsatte side. Ved hjælp rongeurs skræl den dorsale overflade af kraniet væk fra hjernen. Trim væk siderne af skallen ved hjælp rongeurs så godt. Ved hjælp af en spatel, de olfaktoriske pærer og nervøs tilslutninger kappetioner langs den ventrale overflade af hjernen. Forsigtigt driller hjernen væk fra hovedet, trimning enhver dura, der stadig forbinder hjernen til kraniet ved iris saks. Fjernes hjernen og anbringes i et hætteglas af fiksativ indeholdende væske mindst 10 gange volumenet af selve hjernen. Hætteglasset lejlighedsvis. 7. Post-fiksering & Storage Holde hjernen i fiksativ i 24 timer ved 4 ° C, omhvirvling lejlighedsvis. Efter 24 timer hjernen vaskes med phosphatpufret saltvand ved udskiftning af medier 3 gange og omhvirvling hver gang. Hjerner kan derefter opbevares i phosphatbufret saltvand eller HBHS med natriumazid og opbevaret ved 4 ° C. 8. Repræsentative resultater En første indikator for succes perfusionen er clearing af ekstremiteterne såsom næse, ører og ben og indre organer såsom thymus og lever (IHC Verden).Gross inspektion af hjernen afslører blodkar tomrum af blod (hvid til lysegul udseende). Det vil også være sandt i vævssnit afsætte for farvning og immunhistokemi. Den endelige indikator resultat af perfusionen er tilstanden af ultrastruktur i vævet. 1,6,7,8 Forbered Fixativ: Forberede 8% paraformaldehyd lager Tilsæt 40 g Paraformaldehyd til 500 ml dH 2 O. Opløsningen opvarmes til 60 – 65 ° C under omrøring (må ikke overstige 65 ° C, dette kan påvirke succes den immunhistokemiske procedure). Hvis du vil rydde løsningen, reducere varmen og tilsæt 2-3 ml af 1,0 M NaOH med en pipette. Filter og opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned. Fremstille 0,2 M natriumphosphatbuffer, pH 7,4 For monobasisk natriumphosphat lager, og der tilsættes 27,8 g NaH 2PO 4 * H2O til en L dH 2 O. For natrium dibasisk lager, og der tilsættes 28,4 g Na2HPO 4-1 L dH 2 O. Tilsættes 810 ml af monobasiske lager til 190 ml af den dibasiske bestand. Fremstilling af 4% paraformaldehyd Fixative Tilsættes lige dele 8% paraformaldehyd lager til 0,2 M natriumphosphat buffer Bemærk: Denne rettelse er bedst forberedt frisk, ikke mere end 72 timer i forvejen. Forbered Perfusion og opbevaring Buffere: Forberede phosphatpufret saltopløsning, pH 7,4 1 L dH2O 9 g NaCl 144 mg KH 2PO <sub> 4 795 mg Na 2 HPO 4 PH kontrolleres HEPES-bufret Hanks opløsning (HBHS) med natriumazid, pH 7,4 990 ml dH2O 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl 0,06 g KH 2PO 4 0,13 g Na 2 HPO 4 2 g dextrose / glucose 2,4 g 10 mM Hepes 0,1 g MgCl2 6 dele dH2O 0,05 g MgSO4 7 dele dH2O 0,165 g CaCl2 2 dele dH2O 90 mg NaN3 PH kontrolleres Tabel 1. Fremstilling af fiksativ og buffere. Figur 1. </strong> Perfusion Apparater med mærkede komponenter. Figur 2. Udarbejdelse af Perfusion Apparatur I. Begynd med fiksativ linje. Skylle slangen luftbobler og fyldes med buffer ved hurtigt udstøde og tilbagetrækning puffer ind i sprøjten, og gennem ledningen. Lukke ventilen på nåleenden af. Placere fiksativet linje i fikseringsmiddelsammensætningen flasken uden at indføre luftbobler. Figur 3. Fremstilling af Perfusion Apparatus II. 1. Åbne ventilen på nåleenden. 2. Drej buffer ventil (blå) til position for flow. 3. Skyl slangen af luftbobler og fyld med buffer ved hurtigt at udstøde og fratagelse af buffer med sprøjten. 4. Lukker ventil nåleenden. Anbring slangen i bufferen flasken. Test pres for at sikre, at systemet er forseglet korrektly ved at pumpe op manometer pære og se måleren. Apparatet er nu klar til perfusion procedure. Figur 4. Perfusion Apparat position buffer levering. Figur 5. Perfusion Kirurgi I. a) Lav en lateral snit gennem integument og bugvæggen. b) Lav en incision i membranen og skæres på tværs af membranen udsættes hjertet. Gør parallelle snit på hver side af ribberne op til nøglebenet. c) klemme brystbensspids med arterieklemme og placere hæmostat over hovedet. Figur 6. Perfusion Surgery II. a) Før perfusion nål gennem snittet ventrikel ind i aorta ascendens. b) Fastgørperfusion nål bruge ét sæt af hemostats at gribe kraftigt ind i hjertet. Et andet sæt af en modificeret hæmostat kan også anvendes til at klemme aorta omkring nålens spids til forhindrer lækage. Ved hjælp af iris saks lave et lille snit i den bageste ende af den venstre ventrikel. Figur 7. Perfusion med puffer Pump manometeret pæren at skabe tryk i ledningen. Åbn ventilen (1) og tillægger nålehubben. Det er vigtigt at sikre, at ingen luftbobler er indført. Pumpe op på manometeret pære til et tryk på 80 mm Hg og opretholde dette tryk i hele bufferen infusionsperioden. Figur 8. Perfusion med Fixative Når bufferen er næsten færdig (200 ml) skifte pufferen ventilen (1) for at muliggøre fiksativ til at flyde. Trykket kan gradvist øges op tilmaksimalt 130 mm Hg. Figur 9. Dissektion I. a) at fjerne hovedet ved hjælp af et par saks. b) lave et snit i huden langs midterlinien fra halsen til næsen og blotlægge kraniet. c) trimme den resterende halsmusklen således at bunden af kraniet er blotlagt. Hold hovedet, således at den store åbning i kraniet overfladen (foramen magnum) er tilgængelig. Forsigtigt indsætte den skarpe ende af et par iris sakse i foramen magnum og lave et snit. Gentag den samme manøvre for den kontralaterale side. Brug rongeurs for at fjerne kraniet omkring lillehjernen. Figur 10. Dissection II. a) forsigtigt glide saksen langs den indre overflade af skallen. Løft op på spidsen, som du skærer for at forhindre skader på hjernen. Gentage den samme formodsatte side. Anvende rongeurs peel kraniet væk fra hjernen. b) illustration med kraniet fjernet, og hjernen blotlagt. c) anvendelse af en spatel til at adskille de olfaktoriske pærer og nerveforbindelser ved den forreste position af hjernen. Omhyggeligt styre spatelspids langs undersiden af hjernen for at adskille forbindelser for let fjernes. Tag hjerne og placere den i et hætteglas med fiksativ.