Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.
A migração celular é um processo dinâmico, que é importante para o desenvolvimento embrionário, a reparação de tecidos, a função do sistema imunitário, e invasão tumoral 1, 2. Durante a migração direccional, as células movem-se rapidamente em resposta a um sinal de quimiotáctico extracelular, ou em resposta a estímulos intrínsecas 3 fornecidos pela máquina motilidade de base. A migração aleatória ocorre quando uma célula possui direccionalidade intrínseca baixa, permitindo que as células para explorar seu ambiente local.
A migração celular é um processo complexo, na célula resposta inicial sofre polarização e estende-se saliências na direcção da migração 2. Os métodos tradicionais para medir a migração, tais como o ensaio de migração Boyden câmara é um método fácil de medir a quimiotaxia in vitro, o que permite medir a migração como um resultado de ponto final. No entanto, esta abordagem não permite a medição de parâmetros de migração individuais, nem permite a visualização de alterações morfológicas que celular durante a migração.
Aqui, apresentamos um método que nos permite monitorar as células migram em tempo real usando o vídeo – microscopia de lapso de tempo. Desde a migração celular ea invasão são marcas registradas de câncer, este método será aplicado no estudo da migração de células cancerosas e invasão in vitro. A migração aleatória de plaquetas tem sido considerada como um dos parâmetros de 4 a função das plaquetas, por conseguinte, este método pode também ser útil no estudo da função plaquetária. Este ensaio tem a vantagem de ser rápida, fiável e reprodutível, e não necessita de optimização de números de células. A fim de manter as condições fisiologicamente adequados para as células, o microscópio é equipado com CO fornecimento 2 e termostato temperatura. O movimento celular é monitorizada por tirar fotografias com uma câmara montada no microscópio em intervalos regulares. A migração celular pode ser calculado medindo a velocidade média e umdeslocamento MÉDIO, que é calculado pelo software Slidebook.
O tempo real ensaio de migração aleatória permite precisas, a análise, sensível dos parâmetros celulares tais como a velocidade de migração e deslocamento. Este método não é restrita ao fim valor da medição do ponto, por isso é mais quantitativa. Uma vez que, as células são monitorizados em meio DMEM com soro normal de, que reduz o efeito deletério de incubação mais longo em soro meios livres. Tem sido demonstrado que a migração de células depende da formatação e quebrando contactos celulares com…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Amanda Struckhoff pela ajuda inicial com o experimento. Este trabalho foi financiado por uma concessão do NIH 5RO1CA115706.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
Collagen | BD | 354231 | |
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |