Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Resumo

Este método permite a monitorização de células em tempo real e as medições quantitativas de parâmetros diferentes de células, tais como a velocidade de migração, o deslocamento, e velocidade. Ao contrário dos métodos tradicionais, esta abordagem em tempo real não se baseia em medições quantitativas de terminais de migração, em vez disso ele permite o monitoramento e cálculo dos parâmetros diferentes continuamente.

Resumo

A migração celular é um processo dinâmico, que é importante para o desenvolvimento embrionário, a reparação de tecidos, a função do sistema imunitário, e invasão tumoral ^{1, 2.} Durante a migração direccional, as células movem-se rapidamente em resposta a um sinal de quimiotáctico extracelular, ou em resposta a estímulos intrínsecas ³ fornecidos pela máquina motilidade de base. A migração aleatória ocorre quando uma célula possui direccionalidade intrínseca baixa, permitindo que as células para explorar seu ambiente local.

A migração celular é um processo complexo, na célula resposta inicial sofre polarização e estende-se saliências na direcção da migração ^2. Os métodos tradicionais para medir a migração, tais como o ensaio de migração Boyden câmara é um método fácil de medir a quimiotaxia in vitro, o que permite medir a migração como um resultado de ponto final. No entanto, esta abordagem não permite a medição de parâmetros de migração individuais, nem permite a visualização de alterações morfológicas que celular durante a migração.

Aqui, apresentamos um método que nos permite monitorar as células migram em tempo real usando o vídeo - microscopia de lapso de tempo. Desde a migração celular ea invasão são marcas registradas de câncer, este método será aplicado no estudo da migração de células cancerosas e invasão in vitro. A migração aleatória de plaquetas tem sido considerada como um dos parâmetros de ⁴ a função das plaquetas, por conseguinte, este método pode também ser útil no estudo da função plaquetária. Este ensaio tem a vantagem de ser rápida, fiável e reprodutível, e não necessita de optimização de números de células. A fim de manter as condições fisiologicamente adequados para as células, o microscópio é equipado com CO fornecimento ₂ e termostato temperatura. O movimento celular é monitorizada por tirar fotografias com uma câmara montada no microscópio em intervalos regulares. A migração celular pode ser calculado medindo a velocidade média e umdeslocamento MÉDIO, que é calculado pelo software Slidebook.

Protocolo

1. Preparação da placa revestida com colágeno

1. Diluir colagénio para uma concentração final de 10 ug / ml em OPTI-MEM meios de comunicação.
2. Casaco 6 placas de poços com colagénio, pela adição de 1,5 ml a partir do passo 1 a cada poço. Incubar durante a noite a 4 ° C.
3. No dia seguinte, lavar a placa 2 vezes com fosfato 1x salino tamponado (PBS) e armazená-los em PBS.

2. Preparação de células e Sementeira em uma placa de 6 poços

Nota: Use a mídia quentes e PBS para garantir condições óptimas para a movimentação das células

1. Crescer MDA-MB-231 (uma lin....

Discussão

O tempo real ensaio de migração aleatória permite precisas, a análise, sensível dos parâmetros celulares tais como a velocidade de migração e deslocamento. Este método não é restrita ao fim valor da medição do ponto, por isso é mais quantitativa. Uma vez que, as células são monitorizados em meio DMEM com soro normal de, que reduz o efeito deletério de incubação mais longo em soro meios livres. Tem sido demonstrado que a migração de células depende da formatação e quebrando contactos celulares com o substrato ^8,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gêmeos Bio-Products	100-106
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Colágeno	BD	354231
Microscópio com câmara de celular ao vivo e controlador de fase automatizada XY	Olimpo	Olympus 1X81
Câmara de controle ambiental	Neue	Neue Câmara Live Cell	O nosso tem um costume construído com placa retangular de vidro para óptica apropriados através do topo da câmara. A forma rectangular acomoda multi-poços utilizados em muitos dos nossos experimentalts.
Automated fase XY	Prévio	Antes Proscan	Isto permite que retorno preciso para multiplicar as posições XY seleccionados durante a microscopia lapso de tempo.
Câmera		Hamamatsu EM câmera C9100
Software	Normalmente adquirido através de fornecedor do microscópio, como Olympus	Livro Slide 5