Este método permite la monitorización de las células en tiempo real y las mediciones cuantitativas de los diferentes parámetros de la migración, como la velocidad, el desplazamiento y la velocidad. A diferencia de los métodos tradicionales, este enfoque en tiempo real no se basa en las mediciones cuantitativas de migración de punto final, sino que permite el seguimiento y el cálculo de diferentes parámetros de forma continua.
La migración celular es un proceso dinámico, que es importante para el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos, la función del sistema inmune, y la invasión tumoral de 1, 2. Durante la migración direccional, las células se mueven rápidamente en respuesta a una señal quimiotáctica extracelular, o en respuesta a las señales intrínsecas 3 proporcionados por la maquinaria motilidad de base. La migración al azar se produce cuando una célula posee direccionalidad intrínseca baja, permitiendo que las células de explorar su medio ambiente local.
Migración celular es un proceso complejo, en la celda de la respuesta inicial se somete a la polarización y se extiende protuberancias en la dirección de migración 2. Los métodos tradicionales para medir la migración tal como el ensayo de migración de Boyden cámara es un método sencillo para medir la quimiotaxis in vitro, que permite medir la migración como un resultado punto final. Sin embargo, este enfoque no permite la medición de los parámetros individuales de migración, ni permite que Visualización de los cambios morfológicos que sufre durante la migración celular.
A continuación, presentamos un método que nos permite monitorear la migración de células en tiempo real mediante video – microscopía de lapso de tiempo. Dado que la migración celular y la invasión son el sello distintivo del cáncer, este método será de aplicación en el estudio de la migración de las células cancerosas y la invasión in vitro. Migración aleatoria de las plaquetas se ha considerado como uno de los parámetros de la función plaquetaria 4, por lo tanto, este método también podría ser útil en el estudio de las funciones plaquetarias. Este ensayo tiene la ventaja de ser rápido, reproducible, fiable y no requiere la optimización del número de células. Con el fin de mantener las condiciones fisiológicamente adecuados para las células, el microscopio está equipado con CO 2 de suministro y el termostato de la temperatura. Movimiento de las células es controlado por la toma de fotografías con una cámara instalada en el microscopio, a intervalos regulares. Migración de la célula puede ser calculado por la medición de velocidad media y unael desplazamiento PROMEDIO, que se calcula por el software Slidebook.
El ensayo de tiempo real la migración al azar permite precisa, el análisis sensible, de los parámetros de la migración de células tales como la velocidad y el desplazamiento. Este método no se limita a terminar valor del punto de medición, por lo que es más cuantitativo. Puesto que, las células se controlan en condiciones normales de medio DMEM con suero, reduce el efecto deletéreo de incubación más largo en medio libre de suero. Se ha demostrado que la migración de las células depende de el formato y romp…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Amanda Struckhoff para la ayuda inicial con el experimento. Este trabajo fue apoyado por una beca del NIH 5RO1CA115706.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
Collagen | BD | 354231 | |
Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |