Kvantitativ analys av Random migration av celler med Time-lapse video Mikroskopi
Summary
Denna metod tillåter övervakning av celler i realtid och kvantitativa mätningar av olika parametrar cellmigrering såsom hastighet, förskjutning, och hastighet. Till skillnad från de traditionella metoderna, är detta realtid strategi inte bygger på endpoint kvantitativa migration mätningar, utan den ger övervaka och beräkna olika parametrar kontinuerligt.
Abstract
Cellmigration är en dynamisk process, som är viktig för embryonal utveckling, vävnadsreparation, immunsystemets funktion, och tumörinvasion 1, 2. Under riktad migration celler rör sig snabbt som svar på en extracellulär kemotaktisk signal eller som svar på inre signaler 3 tillhandahålls av den grundläggande rörlighet maskiner. Random migration uppstår när en cell har låg inneboende riktning, vilket gör att cellerna att utforska sin närmiljö.
Cell migration är en komplicerad process, i det initiala svaret cellen genomgår polarisering och sträcker sig utskjutande i riktning mot migration 2. Traditionella metoder för att mäta migrationen såsom Boydenkammare migrering analys är en enkel metod för att mäta kemotaxi in vitro, vilket möjliggör mätning av migrering som en slutpunkt resultat. Men gör detta tillvägagångssätt inte mätning av individuella migration parametrar inte heller möjligt att visuanyttjande av morfologiska förändringar som cellen genomgår under flyttningen.
Här presenterar vi en metod som tillåter oss att övervaka migrerande celler i realtid med hjälp av video – tidsförloppet mikroskopi. Eftersom cellen migration och invasion är kännetecken av cancer, kommer denna metod tillämpas för att studera migration cancercell och invasion in vitro. Slumpmässig migrering av blodplättar har betraktats som en av parametrarna av trombocytfunktionen 4, och därför denna metod kan också vara till hjälp för att studera blodplättar funktioner. Denna analys har fördelen av att vara snabb, tillförlitlig, reproducerbar, och kräver inte en optimering av cellantal. För att upprätthålla fysiologiskt lämpliga betingelser för celler, är mikroskop utrustat med CO2 tillförsel och temperatur termostat. Cellrörelse övervakas genom fotografering med en kamera monterad på mikroskopet vid regelbundna intervall. Cellmigration kan beräknas genom mätning av genomsnittlig hastighet och enverage förskjutning, som beräknas genom Slidebook mjukvara.
Protocol
Discussion
I realtid slumpmässiga migration analys möjliggör noggrann, känslig, analys av parametrar cell migration såsom hastighet och förskjutning. Denna metod är inte begränsad till slutvärdet punkt mätning, varför det är mer kvantitativ. Sedan, cellerna övervakades under normal DMEM-medium med serum, minskar den skadliga effekten av längre inkubation i serumfritt medium. Det har visats att migreringen av celler beror på den formatering och bryta cellkontakter med substratet 8, sålunda kan denna metod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Amanda Struckhoff för den ursprungliga hjälp med experimentet. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
References
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
