Summary
成功地利用MALDI - TOF质谱监察PAK2活化蛋白激酶的酰胺氢/氘交换。
Abstract
酰胺氢/氘交换质谱（H / D交换）已被广泛用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用，蛋白质构象变化，蛋白质动力学，蛋白质 - 配体相互作用的接口。 H / D交换骨干酰胺的位置已经被用来测量质谱 1,2,3中的一种蛋白质的微区的氘率。这种方法的分辨率取决于利益氘蛋白的胃蛋白酶消化成肽，通常范围从3-20残留。虽然H / D交换质谱测量的分辨率比单残留的异核单量子相干（HSQC）核磁共振，在H / D交换的质谱测量方法测量的分辨率较低的大小并不局限于蛋白4。 H / D交换是在水溶液中，维持蛋白质构象进行了。我们提供了一种方法，UTILizes 2检测的MALDI - TOF，而不是一个HPLC / ESI（电喷雾电离） - MS系统5,6。 MALDI - TOF提供消化的蛋白质肽的精确质量强度数据，在这种情况下蛋白激酶PAK2（也称为γ-白）。蛋白水解白2进行脱机胃蛋白酶的消化。这另一种方法，当用户不具有访问一个连接到质谱高效液相色谱法和胃蛋白酶列，或当HPLC法测定胃蛋白酶列不会导致在一个最佳的消化地图，例如，大量二硫化物保税分泌型磷脂酶A 2 （SPLA 2）。利用这种方法，我们成功地监测在PAK2激活caspase 3的裂解和自身磷酸化7,8,9氘水平的变化。
Protocol
1。 PAK2激活
- 添加适当的预测试量的caspase 3至20μL缓冲液中12毫克/毫升PAK2（50毫米的Tris - HCl，150 mM氯化钠，2 mM的数码地面电视在pH 7.5）和34℃孵育30分钟完全切割和激活PAK2。
- 分析裂解产物经SDS - PAGE（10％）和Coommassie蓝染色。
- 添加裂PAK2激活缓冲液B（50毫米的Tris - HCl，150毫米15毫米氯化钠，氯化镁2，10毫米ATP）在pH 7.5，在20μL的终浓度为10毫克/毫升PAK2，并孵育34 ° C下30分钟，充分激活自身磷酸化在8个地点PAK2。
- 通过SDS - PAGE 10确定的P34和P27片段的迁移确认PAK2充分裂解。自身磷酸化条件下的适当核查，是通过在一个单独的使用（32 P）ATP或质谱检测磷酸化的实验的放射自显影。
2。鉴定胃蛋白酶的消化PAK2片段
- 加入1毫升0.1％Trifluroacetic酸（TFA），在pH 2.5洗两次琼脂糖珠使用前。然后，离心机在2000 XG的样本，以消除珠15秒。
- 添加PAK2（2μL150 mM氯化钠在20微克，50毫米的Tris - HCl和2在pH为7.5毫米的DTT）100μL0.1％TFA，并与胃蛋白酶偶联的琼脂糖珠30μL的样品孵育5分钟。
- 平衡一个反相高效液相色谱法，在pH值2.5 0.1％TFA的溶剂与主系统的C18柱。胃蛋白酶消化（50μL）使用100分钟线性梯度为0 - 80％，含0.2毫升/分钟的流速在0.1％TFA的乙腈洗脱。馏分收集每2分钟。
- 干燥速度VAC（3 H）的高效液相色谱馏分和重悬在乙腈（5μL）和0.1％TFA（5μL）在pH 2.5的解决方案的样品。
- 最初，每个部分使用的MALDI - TOF PerSeptive生物系统公司的航海家德（STR体育碧肽的筛选osystems，福斯特城，加利福尼亚，美国）。
- 16分数含有肽受到串联质谱使用了Q - TOF质谱仪和一个QSTAR XL oMALDI的MS / MS识别的片段。
- 每个肽的序列是验证与理论的m / z PAK2小学的使用蛋白质勘探者网站（序列为基础的比率由串联质谱产生的产物离子http://prospector.ucsf.edu/）11。
3。测量酰胺H / D交换
- 水浴中，保持所有的解决方案和试剂H / D交换需要在25 ° C。 ATP是溶解于水，pH值调整到7.0，在使用前。额外的4mm ATP在D 2 O缓冲区，以防止稀释后的PAK2 ATP的分离。
- 除了2μL18μL缓冲D 2 O（50 mM的MOPS pH值6.98，125毫米氯化钠）启动H / D交换（20微克）PAK2包含150毫米的缓冲区，50毫米的Tris - HCl（pH值7.5）和2毫米的DTT，导致在10毫克/毫升的PAK2水平和7.0的pH值在0氯化钠° C。
- 孵育样品一式三份，在H / D交换为0，0.5，1，3，5，10分钟，或24小时
- 淬火加入180μL冰冷的0.1％TFA，在pH值2.2，这使在终体积为200μLpH值至2.5的H / D交换过程。对于样品含有ATP，180μL冰冷的0.11％，pH值2.2 TFA是用来保持在淬火条件下的pH值在2.5。
- 等分每个淬火样品（100微升）添加到30μL激活胃蛋白酶偶联的琼脂糖珠。胃蛋白酶的消化允许进行五分钟的冰和样品振荡，每隔30秒。
- 终止于5000 XG样品离心15秒的消化，在4 ° C至删除的胃蛋白酶。
- 迅速冻结于-80 ° C的样品在液态氮和存储不超过2天之前的MALDI - TOF分析。
- 用于MALDI基质为5 mg / ml的α-氰基- 4 -羟基酸（CHCA）溶解在乙腈，乙醇和0.1％TFA在pH 2.5的溶液（1:1:1），在0 ° C举行
- 部分迅速解冻每个样品和混合矩阵和4℃的MALDI靶板上的现货与1μL1μL每个样品。
- 应用温和的真空板，干在30秒点之前的MALDI - TOF分析。之间的样品和光谱检索解冻的时间大约是3分钟。
- 收购一个PerSeptive生物系统航海家DE STR MALDI - TOF质谱。在2 GHz的采样率在100,000个数据通道采集数据，与20,000 - V加速电压和65％的电网电压，使用延迟提取180 ns脉冲延迟。一百扫描，平均每2分钟。 MALDI - TOF仪器并不局限于任何品牌或任何特定的软件。
- 使用数据浏览器4.0的计算机程序calcul吃的每一个片段的氘。
- 计算后的交流基础上的实际注册的氘核数量比例在24小时除以所有可能的交换网站，这是除骨干酰胺的N -末端酰胺（ 图 1）H / D交换。
4。代表性的成果：
通过SDS - PAGE Commassie染色的caspase裂解和自身磷酸化验证。无效PAK2是一个58 kDa的单波段。凋亡的PAK2切割完成，并产生两个片段，P27和P34迁移分开。 autophosphorylated P27和P34的显示，由于完全磷酸化的P27片段（图2）智障迁移的凝胶重叠的迁移。
H / D交换实验进行了多次在0和10分钟（ 图3）之间。作为一个例子，时间当然氘纳入到米/ ZP不活跃的PAK2 1697.85 EAK是随着时间的推移群众信封转变所示的多种同位素峰组成。
图1。公式计算的氘。
图2自身磷酸化和caspase裂解PAK2。 SDS - PAGE和Coommassie蓝染色凋亡裂PAK2（左线），完好无效PAK2（中线）和caspase裂的autophosphorylated PAK2（右线）进行了分析。改编自许，YH等2。
图3。质谱氘注册成立的一个非活动PAK2的时间过程。无效PAK2遭受的H / D exchaNGE为0-10分钟，并用MALDI - TOF分析。在H / D交换的时间当然扩大的MALDI - TOF峰m / z为1697.85同位素分布的一个例子是所示。红色虚线表示平均群众信封和群众信封的转变，显示了一种肽氘。
Discussion
胃蛋白酶消化片段的鉴定是关键的一步，H / D交换实验。不正确识别的肽，会导致错误的结论。胃蛋白酶消化PAK2是通过反相高效液相色谱C18柱洗脱获得一个干净的背景。在我们的实验中，共收集了40分数和遭受的MALDI - TOF。多肽，可确定每个分数。肽串联质谱（Q - TOF MS / MS和oMALDI的MS / MS），以确定它们的DNA序列。肽的MS / MS谱图应至少有三个产品离子，以确认鉴定肽。
数据浏览器4.0的计算机程序（Applied Biosystems公司）执行初始基线校正和噪声过滤。必须校准每个频谱基于两个测序峰。我们我们的频谱校正理论质量的undeuterated m / z为923.45和1697.84。 T他质量校准后的精度可以达到10 PPM。单同位素氘后，可能会转移到一个更高的质量。单一步骤增加这些m / z为比值取得与氘增强人民群众。群众信封峰强度不会影响氘水平。然而，在一个特定的质量信封同位素峰的峰强度计算的平均质量的关键。纳入氘核的计算的第一步是从氘样品的非氘样品减去肽质量。其他因素，D 2 O稀释，侧链和背面的交流中残留的氘核，将需要进一步考虑计算（ 图1） 。 D 2 O稀释，混合后的样品和 D 2 O缓冲区启动H / D 交换 ，D 2 O稀释倍数。胃蛋白酶消化的侧链残留氘核（4.5％）版多肽需要减去。背面交换氘氘和胃蛋白酶消化肽质量测量过程中的所有不可避免的损失。
最溶剂的访问后24小时H / D交换肽（M / Z = 1105.60），代表了全氘地区。每个肽纳入氘核的氘和氘非PAK2消化性溃疡肽的质心之间的差异。最高度氘肽的m / z 1105代表全氘PAK2 24小时的H / D交换时。回到外汇比率计算实际纳入氘核H / D交换肽在m / z为1105的所有可能的交换网站分为24小时。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持这项工作是由国家卫生部批准GM - 26738研究院（翟）的一部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 7789-20-0 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 28166-41-8 | |
| MALDI-TOF | PE Biosystems | Voyager DE STR | |
| Q-TOF mass spectrometer | Q-TOF Ultima-Global | ||
| QSTAR XL oMALDI MS/MS | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer 4.0 computer program | Applied Biosystems |
References
- Anand, G. S., Hughes, C. A., Jones, J. M., Taylor, S. S., Komives, E. A. Amide H/2H exchange reveals communication between the cAMP and catalytic subunit-binding sites in the R(I)alpha subunit of protein kinase. A. J. Mol. Biol. 323, 377-386 (2002).
- Hsu, Y. H., Johnson, D. A., Traugh, J. A. Analysis of conformational changes during activation of protein kinase Pak2 by amide hydrogen/deuterium exchange. J. Biol. Chem. 283, 36397-36405 (2008).
- Englander, S. W., Kallenbach, N. R. Hydrogen exchange and structural dynamics of proteins and nucleic acids. Q. Rev. Biophys. 16, 521-655 (1983).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spectrom. 5, 214-217 (1991).
- Dennis, E. A. Localizing the membrane binding region of Group VIA Ca2+-independent phospholipase A2 using peptide amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 284, 23652-23661 (2009).
- Hsu, Y. H. Calcium binding rigidifies the C2 domain and the intradomain interaction of GIVA phospholipase A2 as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J. Biol. Chem. 283, 9820-9827 (2008).
- Lee, N. Activation of hPAK65 by caspase cleavage induces some of the morphological and biochemical changes of apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13642-13647 (1997).
- Rudel, T., Bokoch, G. M. Membrane and morphological changes in apoptotic cells regulated by caspase-mediated activation of PAK2. Science. 276, 1571-1574 (1997).
- Roig, J., Traugh, J. A. Cytostatic p21 G protein-activated protein kinase gamma-PAK. Vitam. Horm. 62, 167-198 (2001).
- Walter, B. N. Cleavage and activation of p21-activated protein kinase gamma-PAK by CPP32 (caspase 3). Effects of autophosphorylation on activity. J. Biol. Chem. 273, 28733-28739 (1998).
- Clauser, K. R., Baker, P., Burlingame, A. L. Role of accurate mass measurement (+/- 10 ppm) in protein identification strategies employing MS or MS/MS and database searching. Anal. Chem. 71, 2871-2882 (1999).
