Summary
Un metodo per atterramento in modo condizionale espressione di una proteina bersaglio nella retina zebrafish adulto è descritto, che prevede l'iniezione di intravitreally Morpholinos antisenso e electroporating loro nella retina. La proteina risultante è abbattuto per diversi giorni, che consente di testare il ruolo della proteina nella rigenerante o retina intatta.
Abstract
Molte malattie ereditarie degli occhi devastanti provocare cecità progressiva e irreversibile, perché gli esseri umani non possono morire o rigenerare i neuroni della retina malata. Al contrario, la retina zebrafish adulto possiede la capacità di rigenerare spontaneamente robusto qualsiasi classe neuronale che si perde in una varietà di differenti modelli danni alla retina, tra cui puntura di retina, ablazione chimica, concentrato ad alta temperatura, luce ed intenso trattamento 1-8. Il nostro laboratorio ampiamente caratterizzato la rigenerazione dei fotorecettori seguenti costante trattamento con luce intensa e interiore neuroni della retina dopo iniezione intravitreale ouabain 2, 5, 9. In tutti i casi, residenti glia Müller rientrare nel ciclo cellulare per la produzione di progenitori neuronali, che continuano a proliferare e migrare verso lo strato proprio della retina, dove si differenziano in neuroni carente.
Abbiamo caratterizzato cinque fasi diverse durante la rigenerazione della luce-damaged retina che sono stati evidenziati da specifici risposte cellulari. Abbiamo identificato diversi geni espressi in modo differenziale in ogni fase della rigenerazione della retina mediante l'analisi microarray mRNA 10. Molti di questi geni sono critici per lo sviluppo oculare. Per verificare il ruolo di ogni gene candidato / proteine durante la rigenerazione della retina, avevamo bisogno di sviluppare un metodo per limitare in modo condizionale l'espressione di una proteina candidato solo a volte durante la rigenerazione della retina adulta.
Oligo morfolino sono ampiamente utilizzati per studiare la perdita di funzione di proteine specifiche durante lo sviluppo di zebrafish, Xenopus, pulcino, mouse e tumori in xenotrapianti umani 11-14. Queste basepair modificato oligo con sequenza complementare di RNA per bloccare sia la giunzione o la traduzione del RNA bersaglio. Morpholinos sono stabili nella cellula e possono eliminare o espressione "knockdown" proteina da tre a cinque giorni 12.
Qui,descriviamo un metodo efficiente per l'espressione della proteina knockdown bersaglio nella retina zebrafish adulto. Questo metodo impiega lissamina-tagged Morpholinos antisenso che vengono iniettati nel vitreo dell'occhio zebrafish adulto. Utilizzando pinze elettrodo, il morfolino viene poi elettroporate in tutti i tipi di cellule della retina e dorsale centrale. Lissamina fornisce la carica sul morfolino per l'elettroporazione e possono essere visualizzati per valutare la presenza del morfolino nelle cellule della retina.
Knockdown condizionale nella retina può essere usata per esaminare il ruolo delle proteine specifiche in diversi momenti durante la rigenerazione. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato per studiare il ruolo di specifiche proteine nella retina non danneggiato, in processi come la trasduzione visiva e di elaborazione visiva dei neuroni di secondo ordine.
Protocol
1. Morfolino preparazione:
- Tutti oligo morfolino devono essere progettati su misura e ordinato tramite GeneTools (Philomath, OR). Usiamo la carica positiva lissamina-tagged Morpholinos per guidare il Morpholinos elettroporate verso l'elettrodo negativo. Abbiamo provato, senza successo, di bersaglio caricati negativamente fluoresceina tag Morpholinos per l'elettrodo positivo utilizzando questa tecnica. Diluire 300 nmol di morfolino in 100 ml di acqua priva di nucleasi per produrre una soluzione di 3 mm. Aliquota del morfolino in più paraffina sigillati tubi microcentrifuga. Conservare al riparo dalla luce a temperatura ambiente.
- Determinare la concentrazione morfolino diluendo 5 ml di morfolino (o l'acqua usata per diluire il morfolino come bianco) in 95 ml di 0,1 N HCl. Impostare la lunghezza d'onda spettrofotometro (λ) a 265 nm. Calcolare la costante per la vostra morfolino usando la seguente equazione:
Costante = peso molecolare particolare ad ogni tua morfolino X assorbanza 1000/molar. - Troverete il peso molecolare e dati assorbanza molare sulla "Oligo Proprietà" foglio fornite con ogni morfolino. Analizzare il vuoto di verificare le letture di riferimento e le letture di ogni diluito morfolino. Moltiplicare l'assorbanza a 265 nm di ogni morfolino dal suo costante e determinato per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione in ng / mL. Dividere questo numero per il peso molecolare per determinare la concentrazione in mm. Diluire il morfolino, se necessario, ad una concentrazione di lavoro.
2. Rimuovere strato esterno della cornea:
- Anestetizzare 6-12 mesi zebrafish adulto in Tricaine o 2-fenossietanolo a 1,0 mg / ml in acqua serbatoio di zebrafish.
- Zebrafish avvolgere in un asciugamano inumidito pezzo di carta, che copre le branchie, ma lasciando l'occhio esposto. Il pesce avvolto è posto sotto uno stereoscopio e l'ingrandimento è aumentata fino al diametro dell'occhio riempie circa un terzo deiil campo visivo (Figura 1).
- Utilizzando Dumont # 5 pinzette, afferrare la cornea esterna nei pressi della fessura ottica. Questo tessuto è colorato in rosso e viene etichettato come "OC" in Figura 1. C'è una leggera sporgenza o labbro indicato dalla freccia etichettata "CL". Tirare con un angolo basso (cioè 10 gradi) attraverso l'occhio di rimuovere la cornea esterna. Con la pratica, questo può essere completata in un unico movimento. Se la polizza di pinzette, ri-prendere il tessuto e poi tirare con un angolo basso fino alla rimozione. A ben collegata cornea può causare l'occhio ad essere sloggiato dalla presa quando tirato. È possibile mantenere l'occhio di diventare soppiantate da stabilizzando con un'altra serie di pinzette.
3. Incisione della cornea e iniezione morfolino:
- Subito dopo la rimozione della cornea esterna, fare una piccola incisione nella cornea in cui la pupilla incontra l'iride (Figura 2). Questo viene fatto usando uno zaffiro bisturi (vedere Materiali).
- Carico 0,5 l di soluzione 3,0 mm morfolino in un Hamiltsu siringa dotata di un manometro rimovibile 33, smussato-end ago (vedi materiali). Pipetta su e giù per rimuovere le bolle d'aria nella linea. Inserire con cautela l'ago nel vitreo attraverso l'incisione (Figura 2). Non inserire l'ago troppo o si forare la retina o spostare l'obiettivo.
- Iniettare lentamente la soluzione morfolino nello spazio vitreali. A seconda dell'età del pesce, lo spazio vitreali terrà ~ 0,5 microlitri. Dovreste visualizzare vitreo incolore fuoriuscire l'incisione in quanto è spostato dalla soluzione morfolino. Iniettare fino a quando una piccola quantità di perdite di soluzione morfolino fuori dell'incisione. Si consiglia di visualizzare chiaramente il lissamina-tag morfolino all'interno dell'occhio.
- Dopo l'iniezione, ritorno il pesce al serbatoio per il recupero. Noi di solito solo iniettare l'occhio sinistro, con l'occhio destro come controllo uninjected, ma elettroporazione di entrambi gli occhi è possibile.
4. Elettroporazione:
- Seguitol'iniezione di circa 10 pesci, ri-anestetizzare un pesce iniettato e avvolgerla in un pezzo di tovagliolo di carta inumidito, solo che coprono le branchie, ma lasciando l'occhio esposto. Trasferire il pesce ad una piastra di Petri. Indossare guanti in lattice o simili per evitare l'esposizione al anestesia. Mentre delicatamente tenendo il pesce sul fondo del piatto, riempire il piatto con l'anestesia (Figura 3, pannello di sinistra).
- A 3 mm di diametro elettrodo piatto di platino (vedere Materiali) localizza gli impulsi di elettroporazione per circa la metà della retina. Noi di solito bersaglio la retina dorsale. Premere delicatamente l'elettrodo positivo verso il basso sulla metà ventrale dell'occhio. Con la cornea esterno rimosso, l'occhio è facilmente ruotato, esponendo la parte dorsale del bulbo oculare.
- Mentre ancora premendo verso il basso sul lato ventrale degli occhi, posto l'elettrodo negativo vicino (~ 1 - 2 mm), la metà dorsale esposta dell'occhio. Fare attenzione a non toccare l'elettrodo negativo direttamente ad occhio, che si tradurrà in dannila retina dorsale. Dopo aver determinato la giusta distanza tra gli elettrodi, utilizzare la vite di regolazione sul manico degli elettrodi a sostenere che la diffusione quando electroporating. Ciò mantiene l'elettrodo negativo una distanza ottimale dal bulbo oculare quando l'elettrodo positivo è premuto in posizione.
- Electroporate l'occhio con un onda CUY21 Piazza Elettroporatore (vedere Materiali). I parametri di elettroporazione dovrebbe essere impostato su due consecutivi 50-msec impulsi, a 75 V con una di 1 secondo di pausa tra gli impulsi.
- Ritorno di pesce al serbatoio. Noi di solito iniziamo il nostro protocollo per la luce costante degenerazione retinica indotta subito dopo l'elettroporazione.
5. Rappresentante dei risultati:
- Per 3-5 giorni dopo l'elettroporazione (a seconda della stabilità del morfolino), l'etichetta lissamina possono essere visualizzati in tutti gli strati della retina in una retina sezionato (Figura 4). Questo serve come una conferma per la presenza dil'etichetta morfolino.
- Siamo in grado di raggiungere knockdown pieno di proteine fino a 3-5 giorni dopo l'elettroporazione, a seconda dell'efficacia del morfolino (Figura 5). Di solito, durante gli studi il trattamento della luce, raccogliamo gli occhi a 3 o 4 giorni dopo l'elettroporazione morfolino. Questo viene fatto rimuovendo l'intero occhio con Dumont pinze # 5B con estremità ricurva (Figura 6, materiali) e la lavorazione del tessuto per immunoistochimica 15. Come con qualsiasi tecnica smontabile, una dimostrazione di knockdown efficiente deve essere indicato al fine di convalidare il fenotipo. Pertanto, si consiglia di ottenere antisieri per la proteina di interesse. In alternativa, se e degli anticorpi non è disponibile e la morfolino è diretto sia alle accettore giunzione o del sito donatore nel pre-mRNA, bloccherà splicing efficiente del mRNA. In questo caso, è possibile utilizzare trascrittasi inversa-PCR per amplificare le sequenze fiancheggianti nell'RNA morphant e determinare l'efficienza di bloccare il normale splicmodello ing.
- Quando le retine sono sezionati da nasale a temporali lungo l'asse dorsale ventrale, le caselle ombreggiate blu (Figura 6) rappresentano le aree della retina che sono più spesso danneggiati dall'evento elettroporazione stesso. La casella ombreggiata rosa rappresenta l'area cui è destinato l'introduzione morfolino in cellule della retina dalla elettroporazione.
Figura 1. Schematica raffigurante la rimozione degli strati epiteliali della cornea. Il pannello a sinistra mostra le principali caratteristiche strutturali degli occhi, compresa la lente (L), il vitreo (Vit), la retina (R), la cornea esterna (OC), la cornea interna (IC), e la sporgenza della cornea ( CL). L'orientamento degli occhi viene mostrato in basso a destra del primo pannello e viene etichettato anteriore (A), posteriore (P), dorsale (D) e ventrale (V). La colorazione rossa indica l'esterno della cornea che viene rimosso. Il pan secondo el mostra come le pinze sono usate per afferrare la sporgenza della cornea e per tirare la cornea esterna attraverso l'occhio ad un angolo basso (terzo pannello). Il pannello di destra mostra come un secondo paio di pinze possono essere usati per regolare l'occhio mentre si tira la cornea.
Figura 2. Schematica delle fasi coinvolte nel iniezione intravitreale di morfolino. Una piccola incisione viene fatta negli occhi, dove la pupilla incontra l'iride (pannello a sinistra). Il divario risultante dovrebbe essere appena abbastanza grande per un ago da 33 gauge, che viene riempito con la soluzione morfolino, da inserire (pannello centrale). Iniettare lentamente 0,5 ml di soluzione nel vitreo (pannello di destra). Si consiglia di visualizzare una piccola quantità di soluzione vitreali uscire l'incisione come il vitreo è parzialmente sostituito da con-lissamina tag morfolino (pannello di destra).
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Figura 3. Schematica della procedura di elettroporazione generale. Il pesce anestetizzato, che è stato iniettato il intravitreally morfolino, viene delicatamente avvolta in un tovagliolo di carta umido (pannello a sinistra). Il tovagliolo di carta dovrebbe coprire le branchie, ma non ostruire l'occhio (pannello centrale). Premere delicatamente l'elettrodo positivo verso il basso sulla parte ventrale dell'occhio, permettendo la metà dorsale dell'occhio per ruotare dalla presa. Posizionare l'elettrodo negativo di circa 1 mm dalla metà dorsale dell'occhio e avviare l'elettroporazione (pannello di destra).
Figura 4. Immagine confocale a confronto una retina elettroporate senza intravitreally iniettando una lissamina-tagged morfolino (A), e una retina intravitreally iniettato e elettroporate con la lissamina-tag morfolino (B). L'etichetta lissamina si trova in tutti gli strati della retina e tipi di cellule. ROS, asta esternasegmenti; ONL, strato esterno nucleare; INL, strato interno nucleari; GCL, strato di cellule gangliari.
Figura 5. Immagini confocale confronto immunolocalizzazione PCNA nelle retine elettroporate con un morfolino controllo (pannelli a sinistra) e retine elettroporate con un anti-PCNA morfolino (pannelli di destra) prima di luce indotta la morte cellulare dei fotorecettori. Dark-adattato zebrafish adulto albini sono stati messi in luce costante intenso per 1, 2 o 3 giorni dopo l'elettroporazione della morfolino. Il morfolino controllo non è riuscito a reprimere l'espressione PCNA crescente alla luce-retine danneggiate. L'anti-PCNA morfolino efficiente abbattuto l'espressione della proteina PCNA attraverso tre giorni di costante danno luce intensa.
Figura 6. Schematica (pannello di sinistra) che mostra l'enucleazione dell'occhio per pProcessing e criosezionamento, che è fatto lungo l'asse dorsale ventrale. La scatola rosa ombreggiata (pannello di destra) mostra la regione della retina con la maggiore quantità di proteine knockdown utilizzando questa tecnica. Le caselle blu ombreggiate rappresentano le aree che sono più spesso danneggiati dall'evento elettroporazione. L'orientamento degli occhi è l'etichetta anteriore (A), posteriore (P), dorsale (D) e ventrale (V).
Discussion
Recentemente, due analisi microarray ha esaminato i cambiamenti di espressione genica che si sono verificati durante la rigenerazione sia della luce danneggiati retina o di una patch chirurgicamente asportato retina 10, 16. Entrambi gli studi hanno rivelato numerosi geni che mostravano significativi cambiamenti di espressione, sia aumentando o diminuendo, che probabilmente sono necessari per i diversi eventi che si verificano durante la rigenerazione della retina, come il rientro della glia Müller nel ciclo cellulare, ha continuato la proliferazione e la migrazione dei progenitori neuronali per lo strato di danneggiamento della retina, e la differenziazione dei progenitori neuronali nel tipo corretto delle cellule neuronali. Mentre un confronto diretto di questi due dati di microarray set rivelano geni candidati che possono essere coinvolte in questi eventi cellulari, in ultima analisi, questi geni e le proteine codificate devono essere testati per determinare se sono necessarie per la rigenerazione neuronale. Qui, descriviamo un potente perdita di funzione approccio alla conditionalmente knockdown proteine di interesse nella retina zebrafish adulto. Questa tecnica è stata utilizzata per studiare sia le proteine extracellulari e intracellulari, così come molecole di segnalazione, di fattori di trascrizione e proteine necessarie per la replicazione del DNA 17-19. Quindi, questo metodo ha notevolmente aiutato la nostra comprensione del meccanismo molecolare alla base adulto la rigenerazione della retina in zebrafish.
Abbiamo testato i parametri di elettroporazione multipli (tensione, numero di impulsi, il tempo tra gli impulsi) prima di un protocollo di successo è stato raggiunto. Un rapporto precedente di electroporating Morpholinos nella pinna caudale rigenerante zebrafish utilizzate 10 impulsi a bassa tensione (15 V) 20. Poiché la retina zebrafish adulto è circondata da più strati di cellule e non è facilmente accessibile agli elettrodi pinzetta, i parametri utilizzati nella pinna non hanno avuto successo in modo efficiente electroporating Morpholinos nella retina adulta. Al contrario, un alto voltaggio (100 V) spesso resulted nella morte ai pesci. Recentemente, 5 impulsi di 80 V è stato descritto per electroporate DNA plasmidico nella retina topo neonato cucciolo 21. Abbiamo trovato che un po 'meno intenso 2 impulsi di 75 V portato a elettroporazione successo del Morpholinos nella retina zebrafish adulto con la sopravvivenza del 100% del pesce trattata. Inoltre, abbiamo scoperto che la rimozione del più esterno (o esterno-la maggior parte), componente della cornea notevolmente aumentato l'efficienza elettroporazione. Aumentare il numero di impulsi può eliminare la necessità per la rimozione di questo tessuto, ma possono anche causare danni ai tessuti più grande. Studi ampio controllo hanno dimostrato che questi parametri non ha causato alcun decesso significativo delle cellule della retina o alterare le risposte specifiche cellulari osservato durante la rigenerazione dei fotorecettori 19. Guadagno di funzione studi non sono attualmente possibile usare questa tecnica in vivo, a causa della nostra incapacità di electroporate costantemente grandi acidi ribonucleico in tutte le rcellule etinal. Tuttavia, il successo di electroporating plasmidi nella retina del mouse in vivo e la retina zebrafish in espianti suggerisce che è ancora una possibilità in zebrafish 21, 22.
Uno dei punti di forza di questa tecnica è l'elettroporazione sembra introdurre efficacemente il morfolino in tutti i diversi tipi di cellule della retina. Tuttavia, un potenziale punto debole è che l'elettroporazione in modo efficiente consegnato il morfolino nel solo le regioni dorsali e centrale della retina. Un evento elettroporazione secondo verso la metà ventrale della retina risultati in termini di orientamento del bene a tutti i livelli, ma spesso provoca danni. Questa restrizione spaziale probabilmente era dovuto alla forma e il posizionamento degli elettrodi. L'uso di custom-designed elettrodi a forma di coppa che potrebbe essere collocato intorno agli occhi può migliorare questa debolezza. Questa limitazione spaziale della consegna morfolino limita l'uso di questa tecnica e preclude l'uso di un suc testh come l'analisi ERG che richiederebbe una valutazione globale della retina. Va notato che, come per qualsiasi esperimento morfolino, si consiglia di confermare i risultati con un secondo, non si sovrappongono morfolino per l'mRNA bersaglio. In alcuni casi, è possibile electroporate anche due Morpholinos diversi contemporaneamente per knockdown l'espressione di due proteine diverse. Abbiamo dimostrato questa abbattendo l'espressione sia del Pax6a Pax6b e proteine, individualmente e in combinazione 18.
Anche se abbiamo dimostrato l'utilizzo di questa tecnica con il nostro modello di danno luce, potrebbe probabilmente essere utilizzati per studiare la rigenerazione di altri modelli di danno 2-8 o utilizzato per esaminare la funzione delle proteine nella retina danneggiata. Per esempio, elettroporazione di Morpholinos potrebbero essere utilizzati per knockdown l'espressione di specifici canali o molecole di trasduzione del segnale nelle cellule gangliari e amacrine e quindi studiare la funzione di queste segnalazionipercorsi di elaborazione visiva. Tuttavia, come Morpholinos riguardano solo la traduzione di nuova proteina, si dovrebbe attendere fatturato proteina endogena si verifica prima che un test possa essere eseguito. A seconda della stabilità della proteina, che può variare da ore a giorni 18.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare la Vita Freimann Science Center e il Centro per il personale di ricerca Zebrafish per la loro cura e manutenzione del pesce zebra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments, Inc. | 14095 | Any #5 tweezers with work |
| Dumont #5B tweezers with angled tips | World Precision Instruments, Inc. | 500234 | Used to enucleate eye following euthanasia |
| Sapphire blade, double edge lance, 1 mm wide, with Sapphire knife handle | World Precision Instruments, Inc. | Blade: 500314 Handle: 500317 | |
| Hamilton syringe with removable 33 gauge blunt-end needle | Hamilton Co | Syringe: 87930 Needle: 7762-06 | Remove needle that comes with syringe and replace with 33-gauge blunt-end needle |
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