Reproducerbar Mouse iskiasnerven Crush og efterfølgende vurdering af Regeneration af Whole Mount Muskel Analyse

Summary

I denne rapport beskriver vi en metode til at knuse musen iskiasnerven. Denne metode bruger let tilgængelige hæmostatiske pincet og let og reproducerbart producerer komplet iskiasnerven crush. Herudover beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af muskel hele underlag egnet til analyse af nerveregenerering efter iskiasnerven knuse.

Abstract

Regeneration i det perifere nervesystem (PNS) er bredt undersøgt både for dets relevans for sygdom hos mennesker og til at forstå den robuste regenerative respons monteret af PNS-neuroner og derved muligvis belyser svigt i CNS regenerering ^1. Iskiasnerven knuse (axonotmesis) er en af de mest almindelige modeller af perifer nerveskade i gnavere ^2. Knusning afbryder alle axoner, men Schwann-celler basal laminae er bevaret, således at regenerering er optimal ^3,4. Dette tillader undersøgeren for at studere præcist evnen af en voksende axon at interagere med både Schwann-celle-og basal lag ^4. Rotter har generelt været de foretrukne dyremodeller for eksperimenterende nerve crush. De er bredt tilgængelige, og deres læderede iskiasnerven giver en rimelig tilnærmelse af de menneskelige nerve læsioner ^5,4. Selvom mindre i størrelse end rotter nerve, har musen nerve mange lignende kvaliteter. Vigtigst er dog, aftalememorandae modeller er stadig mere værdifuld på grund af den brede tilgængelighed af transgene linier giver nu mulighed for en detaljeret dissektion af de enkelte molekyler kritiske for nerve regenerering ^{6, 7.} Tidligere forskere har anvendt flere metoder til at producere en nerve crush eller skade, herunder simple vinklet pincet, kølet pincet, hæmostatiske pincet, vaskulære klemmer, og investigator-designet skruetvinger ^{8,9,10,11,12.} Efterforskere har også brugt forskellige metoder til mærkning skaden site, herunder sutur, kulpartikler og fluorescerende perler ^13,14,1. Vi beskriver vores metode til at opnå en reproducerbart komplet iskiasnerven crush med præcise og vedvarende mærkning af knuse-site med en fin hæmostatiske pincet og efterfølgende kulstof crush-site mærkning. Som en del af vores beskrivelse af iskiasnerven crush procedure, vi har også en forholdsvis simpel metode til muskel hele montere vi bruger til efterfølgende at kvantificere regenerering.

Protocol

1. Dyreindivider

1,1. Behandling

1. Alle dyr procedurer bør udføres med godkendelse af den lokale institutionens Animal Care and Ethics Udvalg og i overensstemmelse med den anvendelse og Udvalget og National Institutes of Health retningslinjer, med foranstaltninger for at mindske smerter og ubehag.
2. Vores mus blev huset under temperatur-kontrollerede betingelser på en 12-timers revers lys og mørke cyklus, medens fodret mus foder og vand ad libitum.
3. For undersøgelser af voksne regenerering, skal mus være mindst 6 uger gamle, når iskiasnerven knuse udføres. Denne alder er ud over det tidspunkt, hvor beskæring af polyneural neuromuskulære junctions finde sted.
4. I disse eksperimenter anvendte vi 6-8 uger gamle C57BL / 6 mus erhvervet hos Charles River. Når man sammenligner regenerering efter iskiasnerven crush (dvs.: sats på axon vækst) musestammer bør være den samme, som forskelle i axon regenerering har ikke væreted mellem forskellige indavlede stammer ^15,16. Hvis genetisk manipulerede mus vil blive anvendt, kuld kontrollen er mest hensigtsmæssigt.

1,2. Kirurgisk forberedelse

1. Dyr dybt bedøvet i operation under anvendelse af en cocktail af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) via intraperitoneal injektion. Hvert dyr modtager også en subkutan injektion af meloxicam (10 mg / kg) for at minimere postoperative smerter.
2. Begge bagparten er omhyggeligt barberet med en kirurgisk neglesaks (Roboz, RC-5903) og hårfjerning er afsluttet med Nair Hårfjerningscreme (findes på lokalt apotek).
3. Huden bliver renset ved hjælp af sterile bomuld tippes applikatorer og betadin kirurgisk krat (Fisher Scientific, 19.066.452).
4. Ophthalmisk salve (Fisher Scientific, 19.082.795) anvendes til øjnene under anvendelse af sterile bomuld tippes applikatorer.
5. Musen anbringes på en ren plade af rustfrit stål, i hvilket er placeret en forvarmet homeothermic tæppe system (Harvard Apparatus, 507222F). Dyr Temperaturen holdes ved 37 ° C.
6. Alle benene er tapes ned med omhu for at positionere bagbenene symmetrisk, således at knæleddet gør en ret vinkel med legemet (fig. 1, panel A).
7. Det kirurgiske område er dækket med et sterilt afdækningsstykke. Alle instrumenter steriliseres ved autoklavering eller varm perle sterilisering (Fine Science Tools, 18.000-45) og kirurgen bærer en maske, kjole, og sterile handsker.

2. Reproducerbar iskiasnerven Crush

1. Efter fremstilling er en halvcirkelformet indskæring tværs midterlinje (fig. 1) er fremstillet i huden. Huden blidt dissekeret fra den underliggende muskulatur og foldet over at være i vejen under proceduren. Det holdes fugtig ved hjælp af anvendelse af 0,1 ml sterilt saltvand (Hospira, 0409-4888-20) under proceduren.
2. Åbning af fascial plan mellem gluteus maximus og den forreste hoved af biceps femoris afslører ischiasnerven (fig. 1, panel A). For en kirurgisk kontrol, bør den kontralaterale iskiasnerven blive udsat og mobiliseret, men forlod intakt. Bagdelen muskulatur derefter igen imod og sys med en 6-0 flettet silke, ikke-absorberbare suturer (Roboz, SUT-1073-11).
3. Den eksperimentelle hoftenerve eksponeres derefter på samme måde, med retraktor på plads for at lette visualiseringen (fig. 1, panel B). Retraktorerne steriliseres før brug.
   Bemærk: Selvom retraktor systemer er kommercielt tilgængelige, er de ofte ganske dyre. Vi var i stand til at lave en tilfredsstillende retractor system ved hjælp af billige hardware leverancer og insekt stifter (se Materialer afsnit).
4. Ischiasnerven derefter forsigtigt frigjort fra det omgivende bindevæv under anvendelse iridectomy saks.
5. Med en fin 5/45 (Fine Science Tools, 11.251-35) pincet, der er nerven placeret på bunden kæben af ​​en super-fine hæmostatiske pincet (Fin Science Tools, 13.020-12). De tre hæfter sekventielt på linie, ikke ovenpå hinanden (fig. 1, indsat B). De hæmostatiske pincet er indgraveret med et mærke på 1,5 mm fra deres spids. Den yderste del af ischiadicus er placeret i overensstemmelse med dette mærke før crush. Dette sikrer en crush af ensartet bredde, og at nerven ikke strækker sig ud over kæberne i de hæmostatiske tangen når udfladet på grund af belastningen. Hvis nerven strækker sig ud over tang spidsen nerven kun vil blive delvist knust.
6. Den knuste masse gøres vinkelret på nerve ved 45 mm fra den tredje tåen, som målt ved en tråd, der approksimerer bane iskiasnerven. Nerven knuses gang i 15 sekunder ved 3 klik med hæmostatiske pincet. Omhu for ikke at strække nerven. Når hemostats bliver genåbnet, skal hele nerven være gennemskinneligt på crush stedet.
7. Et andet par hæmostatiske pincet (identisk med den første), der er blevet præ-dyppet ipulveriseret carbon (Fisher Scientific, C272-500) anvendes til at markere crush site. Den nerve er knust på samme crush sted i 15 sekunder ved 3 klik. Ingen kulstof mærkningen skal strække sig ud over grænsen for den første crush. Dette er særligt vigtigt, hvis præcis mærkning af knusning stedet er påkrævet. Før anvendelse, er carbonpulver steriliseres ved udsættelse for UV-lys i to timer, og derefter behandles med steril teknik.
   1. Til prædyp-tangen i carbon, men udelukker udbredt carbon på operationsstedet, er tangen åbnes i pulveriseret carbon, derefter forsigtigt lukket (men ikke klikket) lukket, og det carbon på ydersiden af ​​hemostats tørres med steril gaze . De tang kontrolleres under mindst 3x forstørrelse for at kontrollere, at de knusende flader er jævnt belagt med pulveriseret kul. Hvis det er nødvendigt, er de igen dyppet og tørres.
8. Bagdelen muskulatur er igen imod og sutureres på samme måde som den kontralaterale side.
9. Endelig er hudincision lukket ved hjælp af 9 mm refleks clips (World Precision Instruments, 500346; påsætterens: 500345). Hvis 9 mm refleks klip er fundet til at begrænse bevægelse, mindre refleks klip eller 6-0 suturer (Roboz, SUT-1073-11) kan anvendes i stedet.

3. Postoperativ pleje

1. Ved at følge fremgangsmåden, der er dyr anbragt på en varmepude ved 37 ° C, indtil de viser tegn på bevægelse.
2. De flyttede derefter tilbage til deres hjem bur, hvor vand og mad er let tilgængelige på gulvet i form af Hydrogel og fugtet mad.

4. Semi-Thin Forberedelse

1. Efter en overdosis af pentobarbital (300 mg / kg) benet muskulatur fjernes for at blotlægge iskiasnerven *. Med nerve resterende in situ, er bagfjerdingen nedsænket i 2% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatbuffer på is i 30 minutter.
   * Hvis udfylde hele mount muskler forberedelse, er muskler høsted, før du udsætter iskiasnerven.
2. Nerven fjernes omhyggeligt med omhu kun håndtere den proximale ende. Derefter nerven er post-fikseret i det samme fiksativ i yderligere tre timer.
3. Efter fiksering nerven skylles tre gange i 0,1 M phosphatbuffer.
4. Nerven er nedsænket i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M phosphatbuffer i en time.
5. Nerven derefter dehydratiseres ved sekventiel neddypning i mere koncentreret ethanol (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Hver nedsænkning er 15 minutter.
6. Den dehydratiserede nerve inkuberes to gange i propylenoxid i tre minutter.
7. Derefter nerven er nedsænket i en 1:1 blanding af propylenoxid og forankre 812 i mindst 6 timer (sædvanligvis natten over).
8. Derefter nerven er neddykket i en 2:1 blanding af propylenoxid og Indsæt 812 natten over.
9. Endelig er nerve nedsænket i ren Embed 812 i seks timer og derefter indlejret i den passende form og baked ved 60 ° C i 48 timer.
10. 1,0 um snit skæres fra den distale nerve stump ved en indstillet afstand fra den knuste masse sted ved hjælp af en Ultracut UCT ultramikrotom (Leica) med et glas kniv og farvet med toluidinblåt. Tynde sektioner kan også fremstilles til undersøgelse af ultrastruktur ved elektronmikroskopi.

5. Hele Mount Muscle Fremstilling

1. Første mus aflivet med en overdosis af pentobarbital (300 mg / kg) og bagbenene fjernes ved knæene.
2. Fire muskler i bagbenet fjernes til analyse: tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus, og peroneus longus.
3. Alle muskler fjernes via omhyggelig dissektion og fastgjort ved deres bindevæv en sort Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) overtrukket skål. De skylles i PBS og derefter fikseret i 4% paraformaldehyd i 30 minutter.
4. TA derefter skyllet i PBS, indlejret i OCT (Fisher Scientific, 14-373-65), og hurtigt frosset i et bad af acetone og tøris.
   1. Den er lagret ved -80 ° C til tynde sektionering i tilfælde whole mount præparat svigter. I almindelighed er TA for tyk passende hele underlag.
5. EDL, soleus og peroneus longus er skyllet i 3 x 10 minutter i PBS, placeret i 0,1 M glycin * (Fisher Scientific, AC12007-0010; fortyndet i PBS) i 30 minutter og skyllet 3 x 10 minutter i PBS igen. Derefter bratkøles i iskold 100% methanol i nøjagtigt 5 minutter ved -20 ° C, skyllet 3 x 10 minutter i PBS, og badet i fluorescens-konjugeret alfa-bungarotoxin (fortyndet 1:200 i PBS) i 30 minutter. Musklerne skyllet i 3 x 10 minutter i PBS efterfulgt af en en-times blok i 2% BSA (KPL, 50-61-00) og 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) i PBS *, og inkuberet natten over under vipning ved 4 ° C i en cocktail af primære antistoffer fortyndet i den samme 2% BSA/0.2% Triton blok.
   * Gl.ycine og blokerende opløsninger fremstilles på samme dag som muskel høst og omrørt i 30-60 minutter ved stuetemperatur før brug.
   1. At markere axoner og neuromuskulære synapser, anvender vi en kombination af et monoklonalt muse-neurofilament markør (Covance, SMI-312R, fortyndet 1:1000), et muse-monoklonalt synaptisk vesikel markør (SV2 DSHB, fortyndet 1:1000), og rhodamin-konjugeret alpha -bungarotoxin (Sigma-Aldrich, fortyndet 1:200). At markere reaktive Schwann-celler anvender vi kanin-anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, fortyndet 1/500). De primære antistoffer visualiseres med en IgG1 undertype specifikt fluorescein-konjugeret gede-anti-muse-sekundært antistof og DyLight 649 konjugeret æsel-anti-kanin (Jackson ImmunoResearch, fortyndet 1:200).
6. Den følgende dag, musklerne skyllet i PBS i 3 x 10 minutter og inkuberet i sekundære antistoffer fortyndet 1:200 (i 2% BSA/0.2% Triton blokeringsopløsning). Derefter skylles 2 x 10 minutter i PBS, followed af en 5 minutters neddypning i DAPI (Invitrogen, D3571, fortyndet til 300 nM i deioniseret vand), og en anden 10 minutters skylning i PBS.
7. Hver muskel derpå dissekeret på en sort Sylgard (Fisher Scientific, NC9492579) overtrukket petriskål. Indledningsvis sener fjernes ved deres indføring punkter i en muskel, og derefter musklerne fortynding ved bortskrælning indvendige muskelfibre (fig. 3, panel AC). Omhu for at bevare ydre overflade af musklen, herunder endepladen bånd (fig. 3, panel DF). De resulterende muskler er monteret på plus objektglas (Fisher Scientific, 12-550-15) med Vectashield (Vector Laboratories, H-1000) og 22 x 40 mm dækglas (Fisher Scientific, 12-548-5C) er forseglet af klar neglelak på to sider. Ved korrekt monteret på objektglas endepladen bånd i kontakt med dækglas.

6. Måling Regeneration

1. Regenerering kan vurderes i alle tre muskler (peroneus, EDL og soleus). Vi har ofte examin regenerering fjorten dage efter nerve crush, et tidspunkt, hvor en betydelig procentdel af NMJs er re-innerveres. Både tidligere og senere tidspunkter er også egnede, afhængigt af den videnskabelige spørgsmål bliver stillet. I hver muskel, er re-innervation af hele endepladen båndet undersøgt. Kun en face overflade NMJs er scoret. På denne måde kan mindst 200 NMJs pr muskel hurtigt undersøges.
2. At score muskel re-innervation vi fastlægge en "re-innervation ratio". Nævneren er antallet af denerveres neuromuskulære kryds, som er mærket med α-bungarotoxin bindende og Schwann-celle-GAP-43 immunoreaktivitet. Tælleren er antallet af re-innerverede NMJs som er mærket med neurofilament/SV2 immunoreaktivitet. Hvis det er nødvendigt, kan NMJs klassificeres som enten delvist (ufuldstændig dækning af α-bungarotoxin af SV2) eller helt (fuldstændig dækning af α-bungarotoxin af SV2) re-innerveres. For eksempler på re-innerverede og denerverede NMJs se figur 3, panel G og H.

7. Repræsentative resultater

Figur 1. Skematisk af bagbenet anatomi vigtigt at nerve knuse. A. En halvcirkulær hudincision er gjort afsløre underliggende muskulatur. B. gluteale muskulatur er blevet adskilt, og ischiasnerven afslørede (trin 2.4). En pil angiver den omtrentlige crush site. Retraktoren placering er vist som en generel vejledning, og justeres under hver operation for at lette visualiseringen af ischiasnerven og tilgang af hæmostatiske tangen til knusning B (indsat). Placering af ischiasnerven på den nedre kæbe af hæmostatiske tangen lige før knusning (trin 2.5 ovenfor). Separate hæfterne er mærket til at vise, at de er tilstødende vandret, men ikke lodret under knuse. Selvom tre FASCicles mærkes i dette diagram, kan man også se fjerdedel fascicle, at artikulær gren af ​​Peroneal. For en mere detaljeret anatomisk tegning af de forgrenede mønstre af iskiasnerven hæfter distalt for knuse punkt, henvises til Greenes Anatomi Rat, figur 188 ^17.

Figur 2. En carbon-mærket crush stedet in situ og toluidinblåt-farvede, semi-tynde snit af knust hoftenerven. A. Et eksempel på en knusning sted in situ (venstre bagben). Kønrøg betegner crush site. Stjernen markerer en gren af ​​tibiale nerve, der innerverer lårmuskulatur og fungerer som et nyttigt vartegn i løbet crush kirurgi. Den tibiale opdeling af iskiasnerven er skitseret i blå, Peroneal i grønt, og den Sural i gult. B. Semi-tynde sektioner viser et komplet crush udføres med hæmostatisk kraftps. C. Semi-tynde sektioner viser en ufuldstændig crush udføres med vinklede pincet. I begge billeder degenererende myelin profiler er markeret med pilespidser. I panelet C pile markerer eksempler på bevarede myelin profiler og en klynge af sparede axoner. Målestokken er 10 um.

Figur 3 whole mount muskel skematisk og repræsentative NMJs AC.. Afsmeltet billeder af EDL (A), peroneus longus (B) og soleus (C) muskler efter fjernelse fra bagbenet. Viste muskler er fra højre bagben. Knæ og ankel anatomiske orientering er også inkluderet som reference. Sener er farvet hvid og beskrevet i en fast sort linje, når placeret på toppen af ​​musklen. De er beskrevet i en sort stiplet linie, når de strækker sig under musklen. Snit er vist i røde punkterede linier.Muskel skrællet bort fra kløvningspunkter, som angivet med blå pile, og efterfølgende fortyndet. Efter udtynding, er musklen adskilt fra stifterne ved at skære omkring, hvad der er tilbage af de fastgjorte sener DF:. Afsmeltet billeder fra hele mount muskler efter fjernelse af bindevæv og efterfølgende udtynding. Endepladen bånd er beskrevet i hver muskel GH. Soleus whole mount muskel fjorten dage efter iskiasnerveaxotomi crush viser igen innerverede (G) og denerverede (H) neuromuskulære junctions. I disse paneler er NMJs og axoner og Schwann-celler visualiseret som beskrevet ovenfor i afsnit 5.5.1. Acetylcholin receptorer er røde, axoner grøn, og Schwann-celler behandler blå. I panelet G, angiver pilene områder af NMJ, der er blevet re-innerveres af en axon. I panel H Pilehovederne angiver GAP-43 positive Schwann-celle-processer. Bemærk fravær af axoner. Målestokken er 10 um.

Discussion

Vi har præsenteret en metode til at opnå en pålidelig komplet iskiasnerven crush med præcis mærkning af knuse webstedet. Som tidligere nævnt ischiasnerven knuse er en almindelig model af perifer nerveskade i mus og rotter. Selv om hver metode til at knuse har sine fordele og ulemper, fandt vi denne metode produceres et komplet crush, der var let markeret med et minimum af specialudstyr (fx særlige klemmer osv.).

Crush Metoder

Den mest almindelige instrument anvendes til muse iskiasnerven crush er nr. 5 vinklede pincet. Selv om det er muligt at opnå en komplet crush hjælp af denne metode, fandt vi, at dette instrument produceret en variabel crush (for lidt kraft, der forlader sparet axoner eller for store rive nerven), især i hænderne på en ny bruger.

Andre mindre almindelige metoder til fremstilling af knuse omfatte små aneurisme clips, tænger afkølet i flydende nitrogen og specially fremstilles, kalibrerede, ikke-takkede klemmer ^9,12,5,7. Hvert af disse instrumenter kan pålideligt at producere en komplet crush. Vi valgte hæmostatiske pincet fordi instrumentet er let at opnå, frembringer en pålidelig crush og muliggør klar mærkning af knuse-stedet. En ulempe ved de hæmostatiske tangen er, at vi ikke let kan måle den kraft, der frembringes under knuse. Men når testet, vil et hæmostatisk pincet pålideligt at producere en komplet crush, og kan nemt udskiftes med identiske pincet, hvis tangen bliver beskadiget.

Uanset den valgte metode til at udføre en crush, måske den mest kritiske del af knuse procedure er at kontrollere fuldstændigheden af ​​nerve crush. Dette er især vigtigt i hænderne på en ny bruger. Semi-tynd analyse af nerve distalt i forhold til skadestedet (fig. 2) tilvejebringer en enkel metode til at gøre dette kan afsløre en komplet crush (fig. 2, felt B) eller en ufuldstændig crush (fig. 2, felt C).

18. Men længere knuse gange eller knuser, der væsentligt forringer Schwann-celler endoneurium vil ændre kurs og / eller succes regenerering.

Mærkningsmetoder

De to levedygtige fremgangsmåder til knusning stedet mærkning, bortset fra pulveriseret kul er 10-0 sutur gennem epineurium af iskiasnerven ^13,19 og FluoSpheres fremstillet af Molecular Probes, Eugene, OR ¹ in vivo regenerering i YFP muselinjer ^1. Til vores formål har vi fundet carbon mærkning passende og billig, med den yderligere fordel, der let kan ses i den efterfølgende delvis tynde eller elektronmikroskopisk evaluering. Desuden har vi fundet, at carbon-mærkning vedvarer i mindst seks uger gør den egnet til længere varighed eksperimenter.

Analyse af Regeneration efter Crush

En komplet undersøgelsening af post crush regenerering kombinerer funktionelle, elektrofysiologisk, og morfologiske vurderinger ^5,16. Morfologiske vurderinger foretaget regenerering er måske den mest almindelige. Disse vurderinger kan adskilles i de at vurdere latenstiden for vækst på axonal vækst, og specificiteten af reinnervation ^16. I denne rapport, har vi præsenteret en hel mount muskel procedure, der kan bruges til hurtigt at vurdere morfologiske regenerering (Figur 3). I denne analyse denerverede NMJs mærket med alfa-bungarotoxin og Schwann-celler GAP-43 kvantificeres og sammenlignes med re-innerverede knudepunkter, som er mærket ved neurofilament, SV2, og a-bungarotoxin. GAP-43 er markant opreguleres af Schwann-celler efter denervation og pænt identificerer denerveres terminale Schwann-celler ved den neuromuskulære junction ^20. Selvom GAP-43 udtrykkes ved axoner, samtidig brug af neurofilament let adskiller GAP-43 positive axoner fra Schwann celler. Endviderefordi NMJs dybt inde i musklen ikke let kan mærkes ved antistof (sammenlignet med lille molekyle alfa-bungarotoxin) Schwann-celle GAP-43-immunreaktivitet vigtigere bekræfter denerverede status af en neuromuskulær og forbedrer nøjagtigheden ved tælling denerverede NMJs.

Denne fremgangsmåde tilvejebringer en enkel og effektiv metode til at vurdere reinnervation status af hele muskler endepladen bånd på en gang. Andre har anvendt Thy-1-CFP (23) / S100-GFP-mus, der udtrykker cyan fluorescerende protein i axoner og GFP i Schwann-celler til at følge re-innervation af de anteriore tibialis efter hoftenerven crush ^2. Et forbehold skal dog bemærkes. Denne fremgangsmåde afhænger af neurofilament og SV2 immunoreaktivitet at kvantificere re-innervation. Det er muligt, at axon-udvækst kan uhindret men efterfølgende ekspression af SV2 kan forsinkes ^21. Derfor, i nogle forsøg vil det være vigtigt at bekræfte, at forsinket regenerering og ikke delayed præsynaptisk udtryk for SV2 (dvs. præ-synaptisk differentiering) tegner sig for en observeret fænotype.