可重复的小鼠坐骨神经挤压损伤模型及通过完整肌肉标本分析评估再生 关键词：小鼠，坐骨神经，神经挤压，神经再生，完整肌肉标本，神经功能评估

摘要

本报告中，我们描述了一种 crush 小鼠坐骨神经的方法。该方法使用常规可得的止血钳，能够简便、可重复地实现完全的坐骨神经 crush。此外，我们还介绍了一种制备肌肉全装片的方法，适用于在坐骨神经 crush 后对神经再生进行分析。

摘要

周围神经系统（PNS）中的再生现象被广泛研究，不仅因其与人类疾病密切相关，也因为PNS神经元具有强大的再生能力，这可能有助于揭示中枢神经系统（CNS）再生失败的原因¹。坐骨神经 crush（轴突断裂，axonotmesis）是啮齿类动物中最常见的周围神经损伤模型之一²。压迫损伤可中断所有轴突，但施万细胞的基底膜得以保留，从而使再生达到最佳状态^3,4。这种方法使研究者能够精确研究生长中的轴突与施万细胞及基底膜之间的相互作用⁴。通常，大鼠是实验性神经压迫研究的首选动物模型。它们来源广泛，其受损的坐骨神经能较好地模拟人类神经损伤情况^5,4。尽管小鼠神经比大鼠小，但具有许多相似的特性。更重要的是，由于目前转基因小鼠品系丰富，小鼠模型在深入解析神经再生关键分子机制方面的价值日益凸显^{6, 7}。以往的研究者曾采用多种方法制造神经压迫或损伤，包括使用简单斜角镊子、冷却镊子、止血镊、血管夹以及自行设计的夹具^8,9,10,11,12。研究者还使用了多种标记损伤部位的方法，如缝线标记、碳颗粒和荧光微珠^13,14,1。本文描述了一种利用精细止血镊进行可重复且完全的坐骨神经压迫，并结合碳颗粒对压迫部位进行准确、持久标记的方法。在描述坐骨神经压迫操作的过程中，我们还介绍了一种相对简单的肌肉全组织制片方法，用于后续定量评估神经再生情况。

方案

1. 动物实验对象

1.1. 治疗

1. 所有动物实验均应获得当地机构动物护理与伦理委员会的批准，并遵循国家卫生研究院的使用指南和委员会规定，同时采取措施尽量减少动物的疼痛与不适。
2. 我们的小鼠饲养在温度受控的环境中，采用12小时颠倒光照周期，并可自由摄取小鼠饲料和饮水。
3. 在进行成年小鼠再生研究时，实施坐骨神经 crush 损伤时小鼠年龄应至少为6周。此年龄已超过多神经支配的神经肌肉接头发生修剪的时间点。
4. 在本实验中，我们使用了来自 Charles River 的6至8周龄 C57BL/6 小鼠。当比较坐骨神经 crush 损伤后的再生能力（即轴突生长速率）时，应使用相同品系的小鼠，因为不同近交品系之间在轴突再生能力上已观察到差异^15,16。若使用基因改造小鼠，最合适的对照是同窝出生的对照小鼠。

1.2. 手术准备

1. 通过腹腔注射给予动物混合制剂（氯胺酮 100 mg/kg 和赛拉嗪 10 mg/kg）以实现手术所需的深度麻醉。同时，每只动物均接受皮下注射美洛昔康（10 mg/kg），以减轻术后疼痛。
2. 使用外科剪刀（Roboz, RC-5903）仔细剃除双侧后肢毛发，并配合市售脱毛膏（Nair 脱毛霜）完成脱毛。
3. 采用无菌棉签蘸取聚维酮碘外科洗手液（Fish....

讨论

我们介绍了一种可可靠实现坐骨神经完全性压榨损伤并精确定位压榨部位的方法。如前所述，坐骨神经压榨是小鼠和大鼠外周神经损伤的常用模型。尽管每种压榨方法各有优缺点，但我们发现该方法能够产生完全的神经压榨，且仅需最少的特殊设备（例如特殊夹具等），即可方便地标记压榨位置。

破碎方法

用于小鼠坐骨神经挤压最常用的器械是5号斜头镊。虽然使用该方法有可能实现完全挤压，但我们发现该器械产生的挤压效果不稳定（用力过小会导致部分轴突残留，用力过大则会撕裂神经），尤其是在新手操作时更为明显。

其他较少使用的制备压伤的方法包括小型动脉瘤夹、浸于液氮中冷却的镊子，以及专门制造的、经过校准的无齿钳^9,12,5,7。这些器械均可稳定地产生完全压伤。我们选择止血镊是因为该器械易于获取，可产生可靠的压伤，并且便于清晰标记压伤部位。止血镊的一个缺点是无法直接测量压伤过程中施加的力。然而，一旦经过验证，止血镊便能稳定地产生完全压伤；若镊子损坏，也可轻松更换为相同的镊子。