Summary

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Published: February 22, 2012
doi:

Summary

In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l'analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.

Abstract

Rigenerazione del sistema nervoso periferico (SNP) è ampiamente studiata sia per la sua rilevanza per le malattie umane e comprendere la robusta risposta rigenerativa montato dai neuroni PNS così eventualmente illuminano i fallimenti di rigenerazione CNS 1. Schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) è uno dei modelli più comuni di lesioni dei nervi periferici nei roditori 2. Frantumazione interrompe tutti gli assoni delle cellule di Schwann, ma lamine basali sono conservati in modo che la rigenerazione è ottimale 3,4. Ciò consente al ricercatore di studiare proprio la capacità di un assone di interagire sia con il cellule di Schwann e lamine basale 4. I ratti sono stati generalmente i modelli animali preferiti per schiacciamento del nervo sperimentale. Essi sono ampiamente disponibili e la loro nervo sciatico lesionato fornisce una ragionevole approssimazione delle lesioni nervose umane 5,4. Anche se di dimensioni inferiori rispetto ratto del nervo, il nervo mouse è dotato di molte qualità simili. Ma, soprattutto, mousmodelli E sono sempre più prezioso per l'ampia disponibilità di linee transgeniche permette ora una dissezione dettagliata delle singole molecole fondamentali per la rigenerazione del nervo 6, 7. Precedenti ricercatori hanno usato diversi metodi per produrre uno schiacciamento del nervo o lesioni anche semplici pinzette angolate, pinze fredde, pinze emostatiche, pinze vascolari, e morsetti investigatore progettati 8,9,10,11,12. Gli investigatori hanno anche utilizzato vari metodi di marcatura del sito procurando lesioni sutura, particelle di carbonio e perline fluorescenti 13,14,1. Descriviamo il nostro metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico riproducibile completa con un accurato e persistente marcatura del crush-sito utilizzando una pinza emostatica e sottili di carbonio conseguente schiacciamento-site marcatura. Come parte della nostra descrizione della procedura crush del nervo sciatico abbiamo anche incluso un metodo relativamente semplice di montare tutto muscoli che usiamo per quantificare successivamente rigenerazione.

Protocol

1. Soggetti animali 1,1. Trattamento Tutte le procedure sugli animali deve essere effettuata con l'approvazione della Animal Care dell'istituzione locale e del comitato etico e in conformità con l'uso e il Comitato e le linee guida dei National Institutes of Health, con le misure adottate per ridurre al minimo il dolore e disagio. I nostri topi sono stati alloggiati in condizioni di temperatura controllata di 12 ore di luce di retromarcia e del ciclo di scuro, …

Discussion

Abbiamo presentato un metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico affidabile completo con marcatura precisa del sito cotta. Come accennato in precedenza, crush del nervo sciatico è un modello comune di lesione dei nervi periferici nei topi e nei ratti. Sebbene ogni metodo di compressione ha i suoi vantaggi e svantaggi, abbiamo trovato questo metodo ha prodotto una cotta completo che era facilmente contrassegnata con un minimo di attrezzature speciali (ad esempio pinze speciali, ecc.)

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal NIH K08NS065157 (al TAF) Inoltre, il Centro Penn per disordini muscoloscheletrici, Numero P30AR050950 Award dal National Institute of Arthritis, malattie del sistema muscoloscheletrico e Pelle sostenuto questo lavoro (TAF e Steven S. Scherer). Infine, Shriners Pediatric Research finanziamento Seed Center (TAF) ha sostenuto questo lavoro. Vorremmo ringraziare il dottor Young-Jin Son inizialmente per dimostrare tutta la procedura di montaggio e di Amy A. Kim per la sua assistenza nella produzione i disegni della figura 1.

Materials

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Mini Clipper with No. 0000 Blade Roboz RC-5903
Nair Hair Remover (9 oz.) Church and Dwight Co., Inc. N/A
Betadine Surgical Scrub (1 gallon) Fisher Scientific 19066452
Ophthalmic Ointment (1 oz.) Fisher Scientific 19082795

Surgical Tools:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
FST 250 Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45
Iris Scissors (11 cm long) World Precision Instruments 500216
Potts-Smith Forceps (Straight; 18cm; 1×2 Teeth) Fine Science Tools 11024-18
McPherson-Vannas Scissors (5 mm blades) World Precision Instruments 14124-G
Dumont #5 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11252-30
Dumont #5/45 Forceps – Dumoxel Standard Tip Fine Science Tools 11251-35
Ultra Fine Hemostats (Straight; Smooth Inside Surfaces) Fine Science Tools 13020-12
Powdered Activated Carbon (500 g) Fisher Scientific C272-500
Size 6-0 Sutures with C-1 Needle (Sterile, Silk, Black, Braided , Non-absorbable; 18” Length; Box of 36) Roboz SUT-1073-11
Reflex Clip Applier (for 9 mm clips) World Precision Instruments 500345
9mm Stainless Steel Reflex Clips (100/box) World Precision Instruments 500346

Animal Care:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
0.9% Sodium Chloride Injection (Preservative Free; 20 mL) Hospira 0409-4888-20
Complete Homeothermic Blanket System with Flexible Probe (Medium, 115 VAC, 60 Hz) Harvard Apparatus 507222F

Surgical Platform and Retractors:

(purchased at local hardware store)

Name (description/) Quantity
Stainless Steel Platform (Milled; ~12”x12”x1/8”) 1
Button Magnets (Example: Eclipse E825) 3
Stainless Steel Bolts (3” Long; Diameter Determined by Button Magnets) 3
Stainless Steel Nuts (Sized to Fit Bolts) 9
Rubber Bands (Light Tension) 3
Insect Pins (Both Ends Bent to Form Hooks) 3

Semi-Thins:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
Glutaraldehyde (50%; 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18431
Osmium Tetroxide (4% Aqueous, 10 x 10 mL) Ted Pella, Inc. 18465
Propylene Oxide (450 mL) Ted Pella, Inc. 18601
Embed 812 (Kit, for hard blocks/high image contrast) Electron Microscopy Sciences 14120
Toluidine Blue (25 g) Ted Pella, Inc. 19451

Whole Mount Muscle Preparation and Immunohistochemistry:

Name (description/quantity) Supplier Catalogue Number
Paraformaldehyde (1 kg) Sigma-Aldrich P6148-1KG
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (500 g; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific S375-500
Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous (1 kg; Used to Prepare Phosphate Buffer) Fisher Scientific AC38987-0010
10% BSA Diluent/Blocking Solution (200 mL)

Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. 50-61-00
Triton X-100 (100 mL) Dot Scientific Incorporated 9002-93-1
Glycine, 98% (1 kg) Fisher Scientific AC12007-0010
Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (Case of 12; 4 oz bottles) Fisher Scientific 14-373-65
Sylgard DOW 170 (2 lb. Kit) Fisher Scientific NC9492579
Stainless Steel Insect Pins, Size 1 (100/pkg) Fine Science Tools 26001-40
Tetramethylrhodamine-A-Bungarotoxin (0.5 mg) Sigma-Aldrich T0195-.5MG
Mouse Monoclonal Antibody Against SMI-312 (0.1 mL) Covance SMI-312R
Mouse Monoclonal Antibody Against SV2 (0.1 mL) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) SV2
Rabbit Polyclonal Antibody Against GAP-43 Novus Biologicals NB300-143
Flourescein Conjugated Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ Subclass 1 Specific Jackson ImmunoResearch 115-095-205
DyLight 649 Conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-495-152
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, dilactate; 10 mg) Invitrogen D3571
Vectashield Mounting Medium (10 mL) Vector Laboratories H-1000
Superfrost Plus Microscope Slides (White; Size: 75 x 25 mm; Pack of 144) Fisher Scientific 12-550-15
Fisherfinest Premium Cover Glasses (Size: 40 x 22 mm; Pack of 1 oz.) Fisher Scientific 12-548-5C

References

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Cite This Article
Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

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