Denne Metoden beskriver anvendelsen af Infrarødt farvestof baseret imaging system for detektion af H1N1 i bronchioalveolar lavage (BAL) fluid af smitteramte mus ved en høj følsomhed. Denne metodik kan udføres i en 96 – eller 384-brøndsplade, kræver <10 gl volumen af test materiale, og har potentiale for samtidig screening af multiple patogener.
Influenzavirus er en respiratorisk patogen der forårsager en høj grad af sygelighed og dødelighed hvert år i multiple dele af verden. Derfor, præcis diagnose af den inficerende stamme og hurtige high-throughput screening af et stort antal kliniske prøver er altafgørende at kontrollere spredningen af pandemiske infektioner. Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,2.
Her, rapporterer vi udviklingen af en hidtil ukendt diagnostisk teknik, der anvendes til at detektere live influenzavira. Vi brugt musen-adapterede humant A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-virus 3 til teste effektiviteten af denne teknik under anvendelse MDCK-celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 pr brønd) blev dyrket i 96 – eller 384-brøndsplader, inficeret med PR8 og virale proteiner blev påvist under anvendelse anti-M2 efterfulgt af en IR dye-konjugeret secsekundær antistof. M2 5 og hæmagglutinin 1 er to store markørproteiner som anvendes i mange forskellige diagnostiske assays. Anvender IR-dye-konjugerede sekundære antistoffer minimeret den autofluorescens forbundet med andre fluorescerende farvestoffer. Anvendelsen af anti-M2-antistof tillod os at benytte det antigen-specifikke fluorescens intensitet som en direkte metrisk af viral mængde. At optælle fluorescensintensitet, brugte vi LI-COR Odyssey-baseret IR scanner. Dette system bruger to kanals laser-baserede IR-registreringer til at identificere fluorophorer og adskiller dem fra baggrundsstøj. Den første kanal exciterer ved 680 nm og emitterer ved 700 nm til at hjælpe kvantificere baggrunden. Den anden kanal detekterer fluoroforer, at ophidse ved 780 nm og emitterer ved 800 nm. Scanning af PR8-inficerede MDCK celler i den IR scanneren indikerede en viral titer-afhængig lyse fluorescens. En positiv korrelation mellem fluorescensintensitet at virus titer startende fra 10 2 -10 5 PFU kunne consistently observeret. Minimal men påviselige positivitet konsekvent set med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitere vist høj følsomhed af de nær-IR-farvestoffer. Den signal-til-støj-forholdet blev bestemt ved at sammenligne de mock-inficerede eller isotype antistof-behandlede MDCK-celler.
Hjælp af de fluorescensintensiteterne fra 96 - eller 384-brøndsplade formater, vi konstrueret standard titreringskurver. I disse beregninger, er den første variable det virale titer mens den anden variabel er fluorescens intensitet. Derfor, anvendte vi den eksponentielle distributionen til generere en kurve-fit at bestemme polynomium forholdet mellem de virale titere og fluorescens intensiteter. Kollektivt, vi konkludere, at IR farvestofbaseret-baseret protein detektering system kan hjælpe med at diagnosticere inficere virale stammer og præcist optælle titeren af de inficerende patogener.
Den seneste epidemi udbrud af aviær influenza i Sydøstasien og en global frygt for svineinfluenza pandemi pålægge store bekymringer for den offentlige sundhed og sikkerhed. Kritisk fokus har været dedikeret til at generere vacciner til eksisterende og nyere stammer af influenzavirus. Tilgængelighed af hurtige high-throughput teknologier til nøjagtig detektering og nøjagtige virustiter beregninger vil enormt forbedre behandlingen. De mest almindeligt anvendte teknikker anvendes til at beregne virustiter indbefatter plak dannende og influenza hæmagglutination assays. Den plakdannende analysen blev først udviklet til at estimere bakteriofagvektorer titre og blev vedtaget af Renato Dulbecco til at beregne dyr virustitere 4. At udføre denne assay, bliver 10-folds fortyndinger af influenza bestand eller animalske prøver såsom BAL fluid forberedt og 0,1 ml alikvoter podes på den monolag af MDCK celler i 6-brønds plader. Viruset får lov til at adsorbere på de MDCK-celler efterfulgt af annoncendition af et næringsstof medium og agarose. Under inkubationen, frigive de oprindelige inficerede celler virusafkom, der spredes kun for de naboceller. Den cytopatogene virkning af den influenza viral infektion frembringer en cirkulær zone af inficerede celler kaldes en plaque. Hver plak er formodentlig dannet efter infektion af en enkelt celle med en enkelt virus partikel efterfulgt ved replikation af virus. Kontrast mellem de levende celler og de plaques kan forstærkes ved farvestoffer såsom krystalviolet. En væsentlig ulempe ved denne assay er mangel på reproducerbarhed-og enorme variationer inden eksperimenter. En anden assay anvendt til at bestemme influenza virale titer er den hæmagglutineringsassay. Den hemagglutinin-proteinet stede på overfladen af influenza-virusset effektivt binder til N-acetylneuraminsyre-holdige proteiner på mammale og aviær røde blodlegemer 1. Denne interaktion mellem den influenzavirus og de erytrocytterne fører til agglutination i form af en lattice. Den lEvel af agglutinering anvendes til at estimere titer af influenza virus i testprøver. Erythrocyt agglutination assay anvendes kun til at bestemme titrering af en kendt virus og kan ikke bruges til strain identifikation formål. Eftersom dette assay ikke skelnes mellem den levende og de døde vira, er det vanskeligt at opnå en nøjagtig beregning af virale titere.
Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,6. Den nye metode her beskrevne har også klinisk og laboratoriemæssige diagnostisk potentiale. Influenza detektion kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) og BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) anvendelse immunkromatografi assay til påvisning viralt antigen, såsom nukleoprotein 7. Ved hjælp af disse kits, påvisning af virus kan nås inden 15 minutter, men alle negative prøver skal være yderligere screened ved cellekulturen metoden. Forskellige undersøgelser har også rapporteret lav følsomhed af disse kits, især, da infektion var mild eller lav 8. I vores metode, konsekvent vi detektere så lavt som 100 PFU af virus. Dette antyder vores teknik er nyttig i påvisning af H1N1 virus i kliniske prøver, selv når infektionen er mild. A fluorescens-baseret metode til at påvise virale antigener er blevet rapporteret, hvor enten nasopharyngeale Aspirer enhederne blev direkte analyseret eller blev inokuleret på et monolag af modtagelige celler til virusmultiplikation-og efterfølgende analyser 9. Imidlertid er disse metoder begrænset til diagnostiske formål og er ikke egnede til virustiter beregninger. Q-PCR hjælper med at identificere tilstedeværelsen af viralt RNA og ikke estimere den infektiviteten af levende vira. Sammenlignet med disse analyser, vil IR farvestofbaseret analysesystem hjælpe med at afsløre og viral titer opregningen i kliniske prøver og laboratorieprøver. I tilfælde af influenza udbrud, er detkritisk for diagnosticere tusindvis af prøver i en kort tid periode. Vores metode baseret på en 384-brønds plade og IR scanner kan scanne 6-plader på et tidspunkt (> 2.000 prøver), derfor der tilbyder en større fordel over for andre direkte fluorescerende metoder. Feasibility for hurtig behandling af tusindvis af kliniske prøver kan reducere test variation, længden af analysen tid og omkostninger. Brugen af en M2-specifikt antistof byder den fordel af at være uafhængig af stamme forskelle i H og N proteiner. Den M2–proteinet er relativt konserveret i de fleste influenzastammer inficerende mennesker. Hvis antistoffer specifikke for cirkulerende pletter kombineres med vores system man kan måle både titeren af virus og identificere stammen. Imidlertid, eftersom M2 er målet for de Amantadine-lignende medikamenter, kan mutanter opstå, at kan ændre bindingsstedet for den mAb anvendt her. Dette svarer til en potentiel begrænsning for dette system i individer, der bliver behandlet med disse stoffer.
Multipleassays anvendes til at optælle influenzavira titere i testprøver. Til at beregne virus titer, 50% vævskultur infektiøs dosis (TCID 50) og ægprodukter allantoismembraner fluid-baserede assays er almindeligt anvendt 1,10. Men kravene i flere dage at gøre disse metoder mindre pålidelige. Yderligere, i disse fremgangsmåder beregninger baseret på 50% ændring i antallet af plaques tilvejebringe teoretiske men ikke nøjagtig virale titreringer. Plaquedannende assays kan udføres inden for 96 timer; dog, mangel på reproducerbarhed er et stort problem i virale titer beregninger. Den foreliggende teknik her beskrevne har flere særskilte fordele. Først, det er en meget reproducerbar teknik med konsistente resultater. Sekund, virale titer beregninger er baseret på simpel kvantificering af fluorescensintensiteter, der er sammenlignes imod definerede standardkurver. Det tredje, kan to eller flere primære antistoffer blive brugt til at diagnosticere multiple serotyper i en given prøve. Også, IR dye-konjugerede antistoffer har Minimal autofluorescens og er blevet anvendt for celle billeddannelse 11. UV eller visuel stråling (300-600 nM) resulterer i høj cellulær autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af høje kvante ydende endogene fluoroforer. Disse indbefatter aromatiske aminosyrer, Lipo-pigmenter, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, collagen og flavin coenzymer. Dette iboende egenskab af celler gør det vanskeligt at udnytte disse kilder af stråling som prober at kvantificere ekspressionen af specifikke proteiner. I modsætning, begejstre near-IR-farvestoffer og udleder mellem 670-1000 nm. Mange host cellulære molekyler og polyaromatiske hydrocarboner behøver ikke ophidse ved denne bølgelængde og på grund reduceret lysspredning, udsender ekstremt lav baggrundsfluorescens. Yderligere, er vinduet mellem baggrunden og specifik påvisning stærkt forbedret grund af en høj ekstinktion koefficient for de nær-IR fluorophorer. Fotostabilitet, overlegen signal-til-støjforhold, er yderst relevant i kvantificeringen af virale titere. Brug af microfluidic kamre vil automatisere screening proces gennem robot kontrol, og kunne tillade os at teste meget smitsomme kliniske prøver med lethed. Således, udnyttelsen af nær-IR farvestoffer i disse metoder er ideel og meget pålidelig at optælle virale titere i vævsprøver.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes delvis NIH tilskud R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, no1-HHSN26600500032C (til SM). Vi takker vores laboratorium medlemmer for diskussion og teknisk hjælp, Tina Heil for kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi vil gerne takke David Bina, Milwaukee Health Department laboratorium for virus kultur og PCR.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR-biosciences | 9201-01 | |
384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |