Summary
En stor hurdle i de nuværende stamceller er at bestemme den mest effektive metode til at levere disse celler til værtsvævene. Her beskriver vi en chitosan-baserede leveringsmetode som er effektiv og enkel fremgangsmåde, samtidig med at adipøst afledte stamceller for at bevare deres multipotency.
Abstract
Multipotente stamceller har vist sig at være yderst nyttig i forbindelse med regenerativ medicin 1-3. Imidlertid, for at bruge disse celler effektivt til vævsregenerering, skal et antal variable tages i betragtning. Disse variabler indbefatter: den samlede mængde og overfladeareal implantationsstedet, de mekaniske egenskaber af vævet, og vævet mikromiljø, som omfatter mængden af vaskularisering og komponenterne i den ekstracellulære matrix. Derfor skal de materialer der anvendes til at levere disse celler være biokompatible med en defineret kemisk sammensætning under opretholdelse af en mekanisk styrke, som efterligner værtsvævet. Disse materialer skal også være permeabel for oxygen og næringsstoffer for at give en gunstig mikromiljø for celler til at vedhæfte og proliferere. Chitosan, en kationisk polysaccharid med fremragende bioforligelighed, kan let modificeres kemisk og har en høj affinitet til at binde med in vivo macromolecules 4-5. Chitosan efterligner glycosaminoglycan del af den ekstracellulære matrix, således at den fungerer som et substrat for celleadhæsion, migrering og proliferation. I denne undersøgelse har vi anvender chitosan i form af mikrosfærer til levering adipøst afledte stamceller (ASC) i en collagen baseret tredimensional stillads 6. En ideel celle-til-mikrosfære-forholdet blev bestemt med hensyn til inkuberingstid og celledensitet på at opnå maksimale antal celler, der kan indlæses. Når ASC udsås på chitosanmikrosfærer (CSM), er de indlejret i en collagen stillads og kan opretholdes i kultur i længere perioder. Sammenfattet tilvejebringer denne undersøgelse en fremgangsmåde til nøjagtig levering stamcellerne i en tredimensional biomateriale stillads.
Protocol
1. Isolerende adipøst afledte stamceller (ASC)
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Isoler rotte perirenalt og epididymalt fedt-og vaskes med steril Hanks pufrede saltopløsning (HBSS) indeholdende 1% føtalt bovint serum (FBS) som tidligere beskrevet 6.
- Hakket vævet og overføre 1-2 g i 25 ml HBSS indeholdende 1% FBS i et 50 ml rør og centrifugeres ved 500 g i 8 minutter ved stuetemperatur.
- Opsamle fritflydende fedtvæv lag og overførsel til 125 ml Erlenmeyer-kolbe og behandles med 25 ml kollagenase type II (200 U / ml) i HBSS i 45 minutter ved 37 ° C på et orbitalt rysteapparat (125 rpm).
- Forsigtigt fjernes den flydende fraktion (under olie og fedt lag) og filtreres sekventielt gennem en 100 um og 70 um nylon mesh filter. Centrifugeres filtratet ved 500 g i 10 minutter ved stuetemperatur, opsug supernatant og vaskes pellet to gange med 25 ml HBSS.
- Resuspenderes cellebundfaldet i 50 ml vækstmedium (MesenPRO RS Basal Medium) suppleret med MesenPRO RS Growth Supplement, antibiotikum-antimykotikum (100 U / ml penicillin G, 100 ug / ml streptomycin-sulfat og 0,25 ug / ml amphotericin B) og 2 mM L-glutamin og Pipetter celler i 2 T75 kolber (25 ml / kolbe).
- Kultur af ASC i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C (Passage 2-4 ASC anvendes til alle eksperimenter).
2. Klargøring Chitosanmikrosfærer (CSM)
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- CSM er udarbejdet af en vand-i-olie emulgering proces sammen med en ionisk coacervatteknik bruge vores tidligere protokol 6. Emulgere en vandig opløsning af chitosan (6 ml 3% vægt / volumen chitosan i 0,5 M eddikesyre) i en 100 ml af en oliefase bestående af sojaolie, n-octanol (1:2 v / v) og 5% sorbitan-mono-oleat (span 80) emulgator, under anvendelse overliggende (1700 rpm) og magnetisk omrøring (1000 rpm) samtidigt i modsatte retninger. Denne dobbelte fremgangsmåde til blanding sikrer, at miceller dannet tidligt, før tværbinding finder sted, kan forblive i opløsning og ikke sedimentere til bunden. Endvidere magnetisk omrørerstang AIDS i de-aggregering chitosan under micelledannelse og rigidization.
- Blandingen omrøres kontinuerligt i cirka 1 time, indtil en stabil vand-i-olie-emulsion er opnået. Ionisk krydsbinding initieres ved tilsætning af 1,5 ml 1% w / v kaliumhydroxid i n-octanol hvert 15. minut i 4 timer (24 ml totalt).
- Efter færdiggørelse af tværbindingsreaktionen, dekanteres langsomt til oliefasen af blandingen indeholdende CSM og straks de kugler til 100 ml acetone. Vaskes kuglerne med acetone, indtil oliefasen er fuldstændig fjernet.
- Tør de genvundne kugler i en vakuum-ekssikkator og analyze uden yderligere behandling. Den gennemsnitlige CSM partikelstørrelse overfladeareal per milligram og enheden kubisk volumen blev bestemt ved anvendelse af partikelstørrelse-analysator.
- For efterfølgende eksperimenter, vaskes CSM tre gange med sterilt vand til fjernelse af resterende salte og sterilisere med absolut alkohol.
3. Fastsættelsen af antallet af frie aminogrupper i CSM
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Bestemmelse af antallet af frie aminogrupper til stede i CSM efter ionisk krydsbinding ved hjælp af trinitro benzensulfonsyre (TNBS) syre assay Bubins og Ofner 7. Inkuber 5 mg mikrosfærer med 1 ml 0,5% TNBS-opløsning i et 50 ml glasrør i 4 timer ved 40 ° C og hydrolysere ved tilsætning af 3 ml 6 N HCI ved 60 ° C i 2 timer.
- Afkøle prøverne til stuetemperatur, og udtrække de frie TNBS ved tilsætning af 5 ml deioniseret vand og 10 ml ethylether.
- Opvarme en 5 ml prøve af den vandige fase til 40 ° C i et vandbad i 15 minutter for at fordampe alle resterende ether, afkøles til stuetemperatur og fortyndes med 15 ml vand.
- Måle absorbansen ved 345 nm med et spektrofotometer med TNBS-opløsning uden chitosan som blank og chitosan, der anvendes til CSM fremstilling at bestemme det samlede antal aminogrupper. Estimere antallet af frie aminogrupper af CSM i forhold til chitosan.
4. Loading ASC i CSM
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Ækvilibrere 5 mg steriliseret CSM fra afsnit 2.5 i sterile HBSS natten over og tilsættes til en 8-um porestørrelse membran dyrkningsplade insert (24-brønds plade).
- Efter CSM har afgjort på membranen omhyggeligt indsuges HBSS, og der tilsættes 300 pi vækstmedium til indersiden af indsatsen og 700 pi af vækstmedier til the uden for indsatsen.
- Resuspender ASC ved den passende koncentration (1 x 10 4 til 4 x 10 4) i 200 pi vækstmedium og frø over CSM inde i dyrkningspladen insertet. Det endelige volumen af medium i kulturen insertet, efter podning, er 500 uL.
- Inkubér ASC podet på CSM i 24 timer i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
5. Om fastsættelse af ASC Loading og cellelevedygtighed i CSM
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Efter inkubation opsamles ASC-ladede CSM i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør uden at forstyrre cellerne, der er migreret ind i indsatsen membranen.
- Fjernelse af det resterende medium, og der tilsættes 250 pi frisk vækstmedium til røret.
- Til hvert rør tilsættes 25 uL MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid]opløsning (5 mg / ml) og inkuberes i 4 timer i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Efter inkubation fjernes mediet, og der tilsættes 250 pi af dimethylsulfoxid, og vortex blandingen i 2-5 minutter for at solubilisere formazan komplekset.
- Centrifugeres CSM ved 2700 x g i 5 minutter, og bestemme supernatanten absorbansen målt ved 570 nm under anvendelse 630 nm som reference.
- Bestemme celleantallet forbundet med CSM forhold til absorbans, der opnås med et kendt antal levedygtige ASC.
6. Karakterisering af ASC-CSM-Embedded collagengel
Bemærk: Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
- Blanding ASC-fyldte CSM (5 mg indeholdende ≈ 2 x 10 4 celler) med type 1 collagen (7,5 mg / ml) ekstraheret fra rottehalesene ifølge fremgangsmåden Bornstein 8 og fibrillerer efter justering af pH til 6,8 med 2 N NaOH. Tilføje fibrillerede collagen-ASC-CSM blanding til en 12-brønds plade og inkuber i 30 min ved i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Efter fuldstændig fibrillering, inkubere collagen-ASC-CSM geler i op til 14 dage i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
- Frigivelse og migration af celler fra CSM ind i gelen blev observeret ved hjælp af standard-mikroskopi-teknikker.
7. Repræsentative resultater
I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet et in vitro strategi til at levere stamceller fra mikrosfærer (CSM) i en kollagengel stillads. Porøse CSM af ensartet størrelse (175-225 um i diameter) og sammensætning blev fremstillet og anvendt som celle bærere (figur 2). Efter inkubering ASC med CSM, bundet til cellerne i en koncentration på 2 x 10 4 cells/5mg af CSM. Cellerne var i stand til at sprede i mikrosfæren, mens strækker filopodiai de porøse sprækkerne i mikrosfæren (figur 3). Når den celle-fyldte CSM blev blandet med kollagengelen, cellerne begyndte straks at migrere ind i geler (figur 4).
Tabel 1. Biologiske fordele anvendelse af chitosan og kollagen i en stamcelle afgivelsessystem.
Figur 1. Skematisk viser den overordnede strategi for dobbelt anvendelse af ASC-CSM belastede kollagen stilladser. Figur 2, 3 og 4 er kommenteret i skematisk at hjælpe med fortolkningen af billederne.
Figur 2. Skematisk afbildning, der viser processen med podning stamceller på chitosan-mikrosfærer. Process involverer co-dyrkning ASC med CSM i en 8 - um porestørrelse membran kultur pladeindlægget. Efter 24 timer er mikrosfærerne fjernes fra indsatsen og er klar til indstøbning i et biomateriale matrix.
Figur 3. Morfologisk karakterisering af CSM-fyldt med ASC. Panel A viser et lysmikroskopi af ASC-fyldte CSM, medens panel B viser det samme synsfelt overlejret med et billede opnået ved konfokal fluorescensmikroskopi. ASC var forudinstalleret med calcein AM (grøn). Panel C viser et billede af et SEM-billede af en ubelastet mikrosfære, medens felt D viser celler påsat mikrosfære (asterisker). TEM billede i panelet E viser et tværsnit af en ubelastet mikrosfære. En mangfoldighed af porer og sprækker er placeret overalt i mikrosfæren. Panel F viser et tværsnit mikrosfære med celler (pile) fastgjort og strækker filopodia i crelaster. Original forstørrelser: A & B = 70X; C = 500x, D = 2.000 x; E & F = 2.500 x.
Figur 4. Migration af ASC fra CSM til den tredimensionale collagen stillads. Panelerne A og B viser CSM med celler migrere væk fra mikrokugler og ind i kollagenmatrixen på dag 3 (A, pile). Panel B viser en lignende kultur efter 12 dage. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder er vist i C, D og E. Asterisker i C og D viser en mikrosfære, der har været i tværsnit med celler migrere væk fra mikrosfære (pile). Højere forstørrelse af panel D er afbildet i panel E, og viser celle filopodia fastgjort til kollagenfibrillerne (indsat). Oprindelig forstørrelse: A & B = 100x; C & D = 6000 x; E = 20.000 x, indsat = 150.000 x.
Figur 5.Skematisk viser de store anvendelser af CSM i regenerativ medicin og drug delivery.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stor hurdle i stamcelle-baseret terapi er ved at udvikle effektive metoder til levering af celler til de angivne områder til reparation. På grund af patient til patient variabilitet, den vævstype, tilskadekomst størrelse og dybde, skal metode til levering af stamceller afgøres fra sag til sag. Selv indlejring stamceller i en matrix og leverer dem til sårstedet synes at være en næste logiske fremgangsmåde til vævsmanipulering, nogle tekniske forhindringer tilbage. Dette omfatter muligheden af de indlejrede celler til at fastgøre til matrixen og tilvejebringe en biokompatibel omgiver, i hvilket cellerne kan vedhæfte, proliferere og genetablere en egnet mikromiljø før anoikis 9-10. Denne proces kræver, at cellerne opregulerer deres matrix remodeling maskiner, en proces, der kan tage dage for at opnå forud for den ønskede celle processer proliferation, migration og differentiering af stamceller. For at omgå disse problemer, vi have udviklet en metode til forbelastning stamceller ned på chitosanmikrosfærer før indbygges i en egnet matrix til reparation af det beskadigede væv. Ved hjælp af unikke ionisk tværbinding fremgangsmåder til fremstilling af mikrokuglerne, protokollen er i stand til at fremstille> 90% af mikrosfærerne til at være inden 175-225 um i diameter, hvilket medfører en fremragende micro bærer for cellerne. Mere vigtigt, efter tværbinding, forbliver mikrokuglerne positivt ladede, hvilket er yderst gunstigt for cellevedhæftning. Disse mikrosfærepræparater egenskaber giver stamceller for at vedhæfte hurtigt på CSM. Når den er tilsluttet, er disse stamceller mikrosfærer er stabile og i stand til at opnå rumlige arrangementer i stilladset, såsom collagen hydrogeler, at efterligne det beskadigede væv. Sammenfattende tilvejebringer denne protokol en ny fremgangsmåde til at indlæse ASC på CSM og illustrerer, at cellerne i mikrosfærer kan migrere samtidig bevare deres stamcelle-fænotype. Den porøse CSM beskrevne tilvejebringe enfremragende mikromiljø for ASC fastgørelse og stadig tillade cellerne at migrere ind i den omgivende matrix.
Sammendrag:
Kritiske trin
- Anvende ensartet størrelse mikrosfærer, idet variation i diameter direkte påvirker overfladearealet tilgængeligt for cellebinding milligram af mikrosfærer.
- Fremstille en ensartet bed af mikrosfærer i kulturen indsatsen til optimal ensartet binding af cellerne til CSM.
- Sikre, at mængden af mediet tilsættes til den ydre brønd i celledyrkningsinsert er højere end menisk af den indre brønd. Typisk en indvendig: ydre volumenforhold på 1:2 er egnet, da dette letter celler knyttet til mikrosfærerne.
- Distribuere cellen mikrosfærer jævnt i stilladset. Hvis fordelingen af ASC-CSM er for tæt, vil cellerne ikke migrerer fra deres mikrosfærer.
- Den ønskede mængde af CSM og distributionling densitet er afhængig af anvendelsen og skadede væv område.
Begrænsninger
- Denne fremgangsmåde er begrænset til det totale overfladeareal findes på mikrokuglerne. Hvis en højere celletal ønskes, er mere mikrosfærer kræves for at forøge overfladearealet.
- Processen tillader celler at blive podet på den præformede mikrosfærer og er ikke beregnet til celleindkapsling formål.
- Chitosan-mikrosfærer udviklet i denne proces kan understøtte forankrings-afhængige celler, men ikke andre celletyper.
- Idet chitosan-mikrosfærer er udviklet under anvendelse af en 0,5 M eddikesyreopløsning, emulgeret i en olieblanding (sojaolie: n-octanol) og udvindes ved hjælp af organisk opløsningsmiddel er ikke tillader aktive terapeutiske dele udsat for den ovennævnte betingelse.
- CSM har primært til formål at levere celler / stoffer i kortere tid varighed (5-10 dage) på grund af sin hurtigere nedbrydninghastighed, i modsætning til dem er beregnet til langvarig tilgængelighed.
Mulige ændringer og alsidighed (figur 5)
- Mikrokugle størrelse kan modificeres for at ændre det totale overfladeareal. For eksempel kan mikrosfære størrelse reduceres for at forøge overfladearealet / mg CSM, hvilket vil forøge det totale overfladeareal og antallet af celler, der kan fastgøres til mikrosfærerne, hvilket resulterer i en forøget celle belastning pr mikrosfære.
- Chitosan-mikrosfærer kan anvendes som en bærer til at indlæse andre celletyper (endotelceller, pericytter, fibroblast osv.).
- Celle-fyldte kugler (enten enkelt-eller multiple celletyper) kan være indlejret i specifikke steder i stillads. Denne strategi vil bidrage til opbygningen af flercellede vævs-manipuleret scaffolds til vævsregeneration.
- Ud over celle levering kan mikrosfærer også anvendes til at afgive terapeutiske lægemidler (dvs. vækstfaktorer, differentiering inducere og / eller antibiotika). Disse lægemiddelfyldte mikrosfærer kan også anvendes i kombination med celle-fyldte mikrosfærer i et stillads for at forbedre heling og regenerering processer.
Fejlfinding
- Ved udarbejdelsen af CSM, hvis en stor variation i størrelse forekommer, når en række punkter kan indstilles til at give den ønskede CSM størrelse 11.
- Viskositeten af chitosanopløsning. Frisk fremstillet lager foretrækkes at holde opløsningen under konstant viskositet fra batch til batch præparat
- Justere mængden af overfladeaktivt middel (SPAN 80), der anvendes til fremstilling af emulsionen.
- Sikre hastigheden af den overliggende omrører forbliver konstant under hele processen (hastighed kan variere med elektriske strømsvingninger
- Under omrøring formidling atmosfærisk luft kan forårsage turbulens og størrelse variation (dette kan undgås ved at keep væsken krusning, som danner under omrøring, lige over bladene af den overliggende omrører.
- For at sikre optimal celle belastning af mikrokuglerne, kan en kalorimetrisk MTT-assay udføres. Dette vil give et anslået antal af levedygtige celler belastet milligram af mikrosfærer.
- Forhindre sammenklumpning af celle-fyldte mikrosfærer ved at suspendere dem i en lille mængde celledyrkningsmedier før blanding deraf i et stillads, såsom et collagen hydrogel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende økonomiske interesser eksisterer.
Forbehold
De udtalelser eller påstande, der er indeholdt heri, er de private synspunkter fra de forfattere, og er ikke fortolkes som tjenestemand eller afspejler de synspunkter, som Department of Defense og den amerikanske regering. Forfatterne er medarbejdere i den amerikanske regering, og dette arbejde blev udarbejdet som en del af deres officielle pligter. Alt arbejde blev støttet af den amerikanske hær Medical Research og Materiel Kommando. Denne undersøgelse blev gennemført i henhold til en protokol revideret og godkendt af US Army Medical Research og Materiel Kommando Institutional Review Board, og i overensstemmelse med den godkendte protokol.
Acknowledgments
DOZ understøttes af et tilskud fra Genève Foundation. SN blev understøttet af en postdoc Fellowship Grant fra Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
- Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
- Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
- Pountos, I., Giannoudis, P. V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 36, Suppl 3. S8-S12 (2005).
- Kim, I. Y. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).
- Shi, C. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine. J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).
- Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).
- Bubnis, W. A., Ofner, C. M. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
- Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
- Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).
- Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
- Shanmuganathan, S. Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery. Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).
- Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications. Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).
- Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy. FASEB J. 24, 22-31 (2010).
- Zielinski, B. A., Aebischer, P. Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation. Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).
- Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin. Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).
- Baruch, L., Machluf, M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability. Biopolymers. 82, 570-579 (2006).
- Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model. J. Mater. Sci. Mater. Med. , (2011).
- Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).
- Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2010).
- Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).
- Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).
- Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32, 57-64 (2011).
- Altman, A. M., Gupta, V., RÃos, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).
- Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model. Stem Cells. 27, 250-258 (2009).
- Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. 3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).
