Summary
وصفت طريقتين متميزة للنباتات شاشة مع الجذر عقدة الديدان الخيطية. النهج صفها تشمل عالية الإنتاجية شاشات مع الديدان الخيطية بطريقة غير تدميري وتسهيل استخدام هذه النباتات في برامج التربية.
Abstract
الجذر عقدة الديدان الخيطية (جنس Meloidogyne) هي طفيليات مصنع تلزم. هم قارت للغاية وتعتبر واحدة من الديدان الخيطية النباتات الطفيلية الأكثر أهمية من الناحية الاقتصادية. والمجهرية للمرحلة الثانية الأحداث (J2)، molted مرة واحدة في البيض، هي المرحلة المعدية. وJ2s تفقس من البيض، والتحرك بحرية في التربة داخل الفيلم من المياه، وتحديد موقع نصائح جذر من الأنواع النباتية المناسبة. بعد اختراق جذور النبات، تهاجر نحو الاسطوانة الوعائية حيث إنشاء موقع للتغذية والشروع في تغذية باستخدام stylets بهم. ويتألف الموقع التغذية المتعددة الخلايا من خلايا عدة متعدد النوى الموسع تسمى "الخلايا العملاقة التي تتكون من الخلايا التي خضعت karyokinesis (تكرار الانقسام) من دون الانقسام السيتوبلازمي. محيط بالدائرة الخلايا المجاورة تقسيم وتكبير حجمها مما يؤدي إلى مرارة نموذجي أو عقدة الجذر، الأعراض المميزة للعدوى الديدان الخيطية الجذر العقدة. مرة واحدة يبدأ التغذية، J2s تصبح المستقرة والأمم المتحدةdergo 3 molts إضافية ليصبحوا بالغين. من الإناث البالغات يضع 150-250 بيضة في مصفوفة هلامي أو تحت سطح الجذر. من البيض J2s عدوى جديدة يفقس وتبدأ دورة جديدة. اكتمال حياة الديدان الخيطية الجذر العقدة في دورة 4-6 أسابيع في 26-28 درجة مئوية.
هنا نقدم البروتوكول التقليدي لتصيب النباتات، وتزرع في القدور، مع الجذر عقدة الديدان الخيطية وطريقتين لفحوصات عالية الإنتاجية. يتم استخدام أول الإنتاجية العالية طريقة لمحطات مع البذور الصغيرة مثل الطماطم والثاني هو لمحطات مع البذور الكبيرة مثل الفول واللوبيا مشترك. بذور كبير دعم الموسعة نمو البادرات مع تكملة المغذيات الحد الأدنى. أول تجربة إنتاجية عالية وتستخدم الشتلات المزروعة في الرمال في الأدراج في حين أنه في محطات فحص 2 تزرع في الحقائب في حالة عدم وجود تربة. وتتكون الحقيبة نمو البادرات من فتيلة X 15.5 ورقة 12.5cm، مطوية على رأس لتشكيل حوض 2-CM-العميقة التي يتم وضع البذور أو الشتلات. وويرد الفتيل ورقة داخل كيس بلاستيكي شفاف. هذه الحقائب نمو السماح الملاحظة المباشرة من أعراض عدوى الديدان الخيطية، شديد القسوة، من الجذور والبيض الإنتاج الضخم، وتحت سطح الحقيبة شفافة. كلا الأسلوبين تسمح باستخدام النباتات فرزهم، بعد phenotyping، لعبور أو إنتاج البذور. ميزة إضافية لاستخدام الحقائب النمو هو الشرط مساحة صغيرة لأنه يتم تخزين الحقائب البلاستيكية في المجلدات شنقا ترتيبها في الرفوف.
Protocol
1. الطماطم نمو البادرات في القدور والصواني
- لفحوصات وعاء، وبذور الطماطم مصنع في وعاء واحد في العضوية في التربة الغنية مثل مزيج الشمس المشرقة. المحافظة في دفيئة في 22-28 درجة مئوية. بعد الإنبات، وتسميد مرة في الأسبوع مع المعجزة، جرو.
- بعد نحو أسبوعين من الإنبات، في مرحلة صحيح أوراق اثنين، وزرع الشتلات بشكل فردي في قدور (10 سم وقطرها 17 سم العميق) مليئة التربة الرملية العقيمة التي تحتوي على الرمل 90٪ و 10٪ المزيج العضوي. إضافة Osmocote بطيئة الافراج الأسمدة والمحافظة في دفيئة في 22-28 درجة مئوية لمدة أسبوعين. الاستمرار في تسميد النباتات مرة واحدة في الاسبوع مع المعجزة، جرو.
- لعالية الإنتاجية شاشات، بذور النباتات مباشرة في صواني في التربة الرملية، وتغطي علبة مع غلاف بلاستيكي حتى الإنبات والحفاظ على النحو المذكور أعلاه. بعد الإنبات، إضافة Osmocote بطيئة الافراج الأسمدة وتسميد مرة في الأسبوع مع المعجزة، جرو.
2. اللوبيا النمو في أكياس الشتلات
- Sونبتت إما eeds في طبق بيتري، واصطف مع عدة طبقات من ورق Kimwipe، ونقل الحقائب إلى منفردة أو وضعها مباشرة في أخدود ورقة من الحقيبة ونامي.
- وضع الحقائب في مجلد البلاستيك ملف معلق، واثنان في كل مجلد، وترتيب الملفات في رفوف في وضع عمودي. وضع رف في غرفة التحكم والبيئة المحافظة على درجة حرارة 25-28 درجة مئوية و 16 ساعة ضوء / 8 ح دورة الظلام. الرفوف ويمكن أيضا أن يستمر في الاحتباس الحراري، ولكن تحتاج الى احباط شديدة أو غطاء ورقة وضعت على الرف في كلا الجانبين من سيقان النبات، للحد من احتمالات التلوث الفطري.
- المياه في الحقائب مرة أو مرتين يوميا مع الماء التناضح العكسي. حوالي 10 إلى 14 يوما بعد الغرس وعندما يكون نظام الجذر كاف مع نصائح جذور التعليم العالي وقد وضعت (الشكل 1)، والشتلات جاهزة للتلقيح.
3. استخراج بيض النيماتودا
استخراج هيتم تعديل GGS من الجذور المصابة من البروتوكول التي وضعتها هاسي وباركر (1973).
- ثلاثة أو أربعة أيام قبل التلقيح الديدان الخيطية، واستخراج بيض الديدان الخيطية الجذر عقدة من جذور الطماطم المصابة. قبل البدء في استخراج البيض، وغسل منطقة العمل جيدا مع الماء الساخن لتجنب التلوث. غسل أيضا في مياه ساخنة. خلاط، واثنين من الدلاء، ودعم شبكة سلكية، ومطرقة من المطاط، ثلاثة غرابيل من 425 و 90 و 25 فتحة ميكرون، والاسطوانة ومقص
- كومة من المناخل من أعلى إلى أسفل وفقا للترتيب التالي: 425 و 90 و 25 فتحة ميكرون. وسيتم جمع البيض على منخل ميكرون 25 في الجزء السفلي. وضع المناخل على اسلاك معتمدة في بالوعة. وضع دلو تحت اسلاك لجمع حل المدى من خلال.
- قطع قمم محطة المصابة (ق)، وتستخدم كمصدر من اللقاح، وتجاهل. إزالة بعناية النبات من وعاء. غسل جذور بواسطة غمس في دلو من البلاستيك مملوء بالماء. شطف جذور أخرى في إطار تشغيلنينغ المياه حتى يتم غسلها جزيئات التربة بعيدا عن جذور.
- قطع الجذور مع مقص الى قطع صغيرة. التخلص من الجذر الرئيسي.
- وضع جذور المفروم من مصنع واحد في جرة من البلاستيك كبير مع غطاء، إضافة ما يكفي فقط 10٪ محلول التبييض لتغطية الجذور وإغلاق الغطاء.
- هز الجرة التي تحتوي على الجذور لمدة 2 دقيقة.
- فتح جرة وصب على جذور في غربال أعلى وغسل بخرطوم تعلق على فوهة التغشية. يغسل جيدا حتى تختفي كل رائحة مبيض. استخدام مطرقة على الاستفادة من الجانبين من المناخل لتجنب انسداد المسام غربال.
- إزالة غربال أعلى وشطف الركام في غربال الثانية.
- إزالة غربال الثاني وجمع الحطام غرامة، والذي يتضمن البيض، من غربال الماضي. مع تيار لطيف من زجاجة مياه، نقل الحطام إلى جانب واحد من غربال. جمع الحطام والبيض في وعاء نظيف مع الحد الأدنى من المياه.
- منخل مرة أخرى على المياه التي تم جمعها فيدلو من خلال منخل ميكرون 25 إلى جمع أي البيض التي ربما تكون قد لاذوا بالفرار. شطف جيدا بالماء، وجمع في الكأس نفسه.
- تجاهل حطام مصنع من الغربال العلوي واغسل كل غرابيل 3 بالماء المضغوط. لا تلمس جزء من شبكة المناخل لأنها قد تشوه حجم المسام.
4. بيض النيماتودا
- خط سلة معدنية نظيفة مع عدد قليل من طبقات من الورق Kimwipe واحتواءه على طبق بيتري الزجاج. السماح لمسافة 1 سم بين الجزء السفلي من سلة وطبق هذا.
- صب بيض الديدان الخيطية المستخرج على ورقة في سلة الأسلاك. إضافة السائل بما فيه الكفاية بحيث يكون الجزء السفلي من سلة سلك تلامس سطح الماء ولكن لم يتم مغمورة في الماء. يغطي الجزء العلوي مع غطاء من البلاستيك.
- كل يوم تحقق من تبخر الماء وإضافة بعض الماء في طبق بتري بحيث الجزء السفلي من سلة تلامس الماء. وذلك لمنع البيض من الجفاف.
- كل يوم، وجمع واثالثا الذي يحتوي على J2s من أطباق بتري في دورق. إذا لم يتم استخدامها فورا، تهوية واللقاح التي تم جمعها في درجة حرارة الغرفة باستخدام العرض الجوي مختبر أو الهواء الناتجة عن مضخة ماء. استخدام اللقاح الهوائية في غضون أيام 2. ويمكن جمع J2s من الفقس وضع على مدى فترة من 6-8 أيام.
5. الطماطم العدوى الجذر في القدور أو صواني والتقييم من العدوى
- استخدام ثلاثة aliquots من الديدان الخيطية التي تم جمعها لحساب عدد من J2s في شريحة العد أو طبق، وحساب متوسط وتحديد حجم المطلوب للتلقيح. وعادة ما تستخدم 3000 J2s لكل مصنع في الأواني و 500 J2s عن النباتات التي تزرع في صواني الشتلات.
- تحريك اللقاح على لوح التحريك المغناطيسي على سرعة منخفضة.
- قبل تلقيح النباتات، وتأكد من أن تكون التربة رطبة ولكن ليس رطبة جدا. للتلقيح وعاء، وجعل ثلاثة ثقوب من عمق حوالي نصف وعاء في الرمال حول كل الطماطم نظام الجذر باستخدام قلم رصاص (الشكل 2
- لشاشات عالية الإنتاجية في الصواني، واستخدام تعديل إبرة طرف مختوم مع فتحات على الجانبين لاصق على طرف ماصة 5 مل على طول pipetter (الشكل 3) لتسليم J2s في التربة. بدلا من ذلك، يمكن تسليمها النيماتودا كما في الخطوة 5.3.
- المحافظة على النباتات في الدفيئة في 24-27 درجة مئوية لمدة ستة الى ثمانية اسابيع. تواصل تخصيب مرتين في الشهر مع معجزة، غرو.
- لتقييم العدوى، وإزالة النباتات بعناية من الأواني وغسل الجذور (كما هو موضح في الخطوة 3.3).
- وصمة عار على الجماهير الزرقاء البيض من قبل غمر جذور في 1 ملغم / لتر erioglaucine، لمدة 15 دقيقة.
- شطف جذور في المياه، وتقييم من قبل العد الجماهير البيض الملون على نظام الجذر الفردية. يمكن استخدام المكبر مكتب مضيئة للمساعدة في تصور الجماهير البيض.
- إذا كانت هناك حاجة النباتات لتحري المزيد من زدراسات enetic، لا قطع قمم قبل غسل جذور للتقييم. بعد تلطيخ والعد الجماهير البيض، وزرع الشتلات في العضوية في التربة، تقليم قمم بشكل كبير للحد من النتح، والحفاظ في دفيئة.
6. اللوبيا العدوى الجذر في الحقائب والتقييم من العدوى
- عد اللقاح الخيطية ويقلب على لوح التحريك المغناطيسي كما هو موضح سابقا.
- إزالة الحقائب من المجلدات شنقا ومكان على سطح أفقي. تطعيم كل الحقيبة مع 1500 J2s في 5 مل. رفع الغطاء البلاستيك من الحقيبة وتوزيع الديدان الخيطية بالتساوي على سطح جذور.
- الحفاظ على الحقائب في وضع أفقي لمدة 24 ساعة بعد التطعيم، مع تغطية ورقة الظلام لاستبعاد الضوء، ثم تعود إلى المجلدات شنقا في غرفة النمو.
- المياه والنباتات حسب الحاجة، مرة أو مرتين يوميا، مع حل هوغلاند في نصف قوة (هوغلاند وأرنون، 1950؛ الجدول رقم 1
- 30 يوما تقريبا (المدى 28-35 يوما) بعد التلقيح، ويبث كل الحقيبة مع حوالي 10-20 مل من erioglaucine ملغم / لتر 75. الحفاظ على الحقائب غمرت مع الصبغة في وضع أفقي بين عشية وضحاها.
- استنزاف الحقائب وتقييم نظم الجذرية عن طريق حساب الجماهير البيض تحت المكبر مكتب مضيئة.
- إذا كانت هناك حاجة النباتات فرزهم للدراسات الجينية مزيد من العمل أو التربية، وسحب بعناية الجذور من عملية الزرع، ورقة في التربة العضوية في الأواني والحفاظ على المسببة للاحتباس الحراري.
7. ممثل النتائج
وتظهر في المراحل المناسبة من نباتات الطماطم واللوبيا عن التطعيمات الخيطية للنظامين وصفها في أرقام1 و 2. وبالإضافة إلى ذلك، تظهر أمثلة جيدة المصابة جذور الطماطم واللوبيا في أرقام 4 و 5. كما هو الحال في معظم الشاشات مقاومة المرض، فإنه من المستحسن أن تستخدم ما لا يقل عن 6-10 النباتات في التركيب الوراثي للتلقيح الخيطية لحساب متوسط معدل العدوى. التباين في عدوى الديدان الخيطية بين النباتات، من النمط الجيني نفسه، يمكن تخفيض باستخدام موحدة حجم المصنع وكمية دقيقة وتسليم من اللقاح.
استخدام الأدراج والحقائب نمو تمكن من فحص مئات الآلاف من النباتات في مساحة نمو صغير. الحقائب نمو تسمح أيضا سريعة وفعالة غير مدمرة تقييم التهابات الديدان الخيطية الجذر عقدة مع عدم وجود حاجة لغسل الجذور (الشكل 4).
الشكل 1. A 2 مصنع أسابيع اللوبيا نمت في الحقيبة وجاهزة للعقدة الجذر NEMAtode تلقيح.
الشكل 2. لمدة ثلاثة مصنع الطماطم أسابيع جاهزة للتلقيح الخيطية الجذر العقدة.
الشكل 3. إبرة وتعديل رأس ماصة تستخدم لتلقيح عالية الإنتاجية من الديدان الخيطية. وختم الجزء السفلي من إبرة وتم حفر ثلاث مجموعات من الثقوب في إبرة باستخدام أشعة الليزر. ثم، تم لصقه على إبرة تعديل لطرف ماصة 5 مل.
الشكل 4. نظام الجذر طماطم مصابة بعقدة الجذر الديدان الخيطية.
الشكل 5. نظام الجذر اللوبيا مع الجماهير البيض ملطخة erioglaucine 30 يوما بعد التلقيح نمت في28 درجة مئوية.
Discussion
هناك نوعان من الخطوات الحاسمة لشاشة الخيطية الناجحة: إعداد اللقاح معدية للغاية واستخدام النباتات في هذه المرحلة التنموية المناسبة. معدل فقس بيض نيماتودا الجذور عقدة متغير بدرجة كبيرة ويتراوح ما بين 5 - 50٪. ولذلك للحصول على المستويات المثلى من فتحة وJ2s معدية للغاية، يجب إيلاء اهتمام وثيق لاستخراج البيض والإجراءات الفقس. وينبغي أن يتعرض البيض لتبييض لفترة زمنية الحد الأدنى، وينبغي أن تشطف التبييض بشكل جيد من خليط الجذر. عندما فقس البيض، لا ينبغي أن الطين الذي يحتوي على البيض أن يغطس في الماء. وبالإضافة إلى ذلك، تجنب إراقة البيض في صحن بيتري الأساسية حيث يتم جمع الأحداث التي تحاك. طريقة واحدة لتجنب إراقة البيض أثناء عملية الفقس هو عدم إضافة الماء مباشرة إلى Kimwipe باعتبارها ورقة قد كسر. بدلا من ذلك إضافة الماء مباشرة إلى طبق بيتري.
للحصول على أفضل النتائج، استخدم J2s فقست حديثا. إذا كان hatcح معدل منخفض وهناك حاجة إلى مزيد من اللقاح، يمكن تخزين J2s عند 15 درجة مئوية لفترة أطول. تدفئة اللقاح المخزنة على درجة حرارة الغرفة لإحياء الديدان الخيطية قبل التلقيح. ومع ذلك، لا تخزين J2s لفترات طويلة حتى عند 15 درجة مئوية كما J2s المتعطشة لن تصيب بكفاءة.
شتلة الشباب هي أفضل مرحلة تنموية لتلقيح الخيطية الجذر العقدة. ومع ذلك، هذا يجب أن يكون متوازنا مع تشكيل نظام الجذر كاف توفير أعداد كافية من نصائح جذر كنقاط دخول لJ2s. الحفاظ على أمثل حالة نمو النبات هي أيضا حاسمة بالنسبة للشاشات. تجنب الإفراط في سقي النباتات خاصة تلك التي تزرع في الحقائب. الإفراط في الري والحقائب، كما يتبين من المياه الراكدة في الجزء السفلي من الحقيبة، ويمكن أن تعزز نمو الفطريات ويقلل من صحة الجذر.
مع تقييم المقايسات على حد سواء المزيد من عدوى الديدان الخيطية وحساب عدد البيض / نظام الجذر والبيض / غرام من الصحائفلا يمكن أن يؤديها ش الجذر. لفحوصات الطماطم، ويتم وزن الجذور الفردية واستخراج البيض كما هو موضح لتحضير اللقاح (القسم 3). عند معالجة عدد كبير من العينات النباتية، يمكن أن متآكلة نظم الجذور الفردية باستخدام الخلاط لاستخراج البيض. ينبغي أن يحسب عدد البيض في ما لا يقل عن 3 aliquots وحساب بيض / غرام من نظام الجذور الطازجة. لفحوصات الحقيبة، يتم سحبها نظام الجذر قبالة إدراج ورقة، وزنه، واستخراج البيض.
Disclosures
ليس لدينا ما يكشف.
Acknowledgments
ويتم تمويل البحوث في مختبر Kaloshian عن طريق منحة من معهد الولايات المتحدة الوطني للأغذية والزراعة (2007-35607-17765). ويتم تمويل البحوث في مختبر روبرتس من المنح المقدمة من الوكالة الأمريكية للتنمية الدولية (GDG-G-00-02-00012-00 وEDH-A-00-07 00005-) وجاف كاليفورنيا المجلس الاستشاري للفول.
References
- Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway. Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).
- Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci. 40, 611-618 (2000).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).
- Hussey, R. S., Barker, K. R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).
- Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J. 27, 417-425 (2001).
- Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).
- Omwega, C. O., Roberts, P. A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).
- Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis. 72, 970-972 (1988).
- Perry, R. N. Root-Knot Nematodes. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).
- Starr, J. L., Cook, R. Resistance to Parasitic Nematodes. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
