Summary
루트 매듭 nematodes있는 화면 식물 별개의 두 가지 방법이 설명되어 있습니다. 설명한 방법은 번식 프로그램에서 이러한 식물의 이용을 촉진 비파괴 방식으로 nematodes과 높은 처리량 화면을 포함합니다.
Abstract
루트 - 매듭 nematodes가 (속 Meloidogyne) 고맙게 여기게 식물 기생충입니다. 그들은 매우 polyphagous하고 가장 경제적으로 중요한 식물 기생 nematodes 중 하나로 간주됩니다. 계란에 한번 molted 미세한 두 번째 단계는 청소년 (J2)는, infective 단계입니다. J2s는 계란에서 부화 물을 필름 내에 토양에서 자유롭게 이동하고, 적합한 식물 종의 루트 도움말을 찾습니다. 그들이 먹이 사이트를 구축하고 stylets를 사용하여 먹이를 시작할 위치를 식물 뿌리를 관통 후, 그들은 혈관 실린더으로 마이 그 레이션. 다세포 먹이 사이트는 cytokinesis없이 karyokinesis을 (유사 분열을 반복) 받았습니다 세포에서 형성되는 '거대 세포'라 불리는 몇몇 확대 multinuclear 세포 구성되어 있습니다. 이웃 pericycle 세포는 분열과 크기가 일반적인 담즙 또는 루트 매듭, 루트 매듭 선충류 감염의 특징적인 증상을 유발 해주 확대. 일단 수유가 시작되면 J2s는 정주의 및 취소 될성인이 될 세 개의 추가 molts을 dergo. 성인 여성은 루트의 표면이나 아래에 젤라틴 매트릭스에 150-250 알을 낳는. 계란에서 새로운 infective의 J2s 까기 새로운 사이클을 시작합니다. 루트 매듭 선충류 수명주기는 26-28에서 4~6주에 완료됩니다 ° C.
여기 루트 매듭 nematodes 및 높은 처리량 assays를위한 두 가지 방법과 화분 재배 식물, 감염 전통적인 프로토콜을 소개합니다. 두 번째는 그러한 cowpea 및 일반 콩 같은 대형 씨앗과 식물에 대한 반면 첫 번째 높은 처리량 방법은 같은 토마토와 같은 작은 씨앗과 식물에 사용됩니다. 대형 씨앗은 최소한의 영양 보충과 확장 묘목의 성장을 지원합니다. 첫 번째 높은 처리량 분석은 두 번째 분석 식물에서 토양의 부재에있는 파우치 재배하는 동안 트레이에 모래 재배 모종을 활용합니다. 묘목의 성장 주머니는 씨앗이나 모종이 배치되는 2-CM-깊이 여물을 형성 상단에 접혀, 15.5 X 12.5cm 종이 심지로 만들어졌다.종이 심지는 투명 비닐 주머니 안에 들어 있습니다. 이러한 성장 파우치는 투명 주머니의 표면 아래 뿌리와 달걀 대량 생산의 갤링 선충류 감염 증상의 직접 관찰하실 수 있습니다. 두 가지 방법은 생산을 건너거나 씨앗에 대해 phenotyping 후, 스크린 식물의 사용을 허용합니다. 파우치가 랙에 배치 플라스틱 걸려 폴더에 저장되기 때문에 성장 파우치의 사용으로 추가적인 장점은 작은 공간 요구 사항입니다.
Protocol
1. 냄비와 트레이에 토마토 묘목 성장
- 위해 냄비 assays 같은 선샤인 믹스와 같은 유기 풍부한 토양에서 하나의 냄비에 공장 토마토 씨앗. 22-28에서 온실에서 유지 ° C. 발아 후 촉진제와 함께 일주일에 한 번씩 거름.
- 약 2 주 발아 후 두 진정한 잎 단계에서, 90 %의 모래와 10 %의 유기 혼합을 포함하는 무균 모래 흙으로 가득 냄비 (10cm 직경과 깊이 17cm)에 개별적으로 묘목을 이식. 느린 릴리스 비료를 Osmocote 두 주 동안 22-28 ° C에서 온실에서 유지하는 추가합니다. 촉진제와 함께 일주일에 한 번씩 식물을 비옥하게하기 위해 계속합니다.
- 높은 처리량 화면을 보려면 직접 모래 토양의 쟁반에있는 식물의 종자가 발아까지 플라스틱 랩과 트레이를 커버하고 위의 유지합니다. 발아 후, 느린 릴리즈 비료를 Osmocote 및 촉진제와 함께 일주일에 한 번은 비옥 추가합니다.
2. 묘목의 파우치에 Cowpea 성장
- Seeds는 중, 배양 접시에있는 germinated Kimwipe 종이를 여러 레이어 줄지어 및 파우치에 홀로 전송 또는 파우치의 종이 홈에 직접 배치하고 germinated됩니다.
- 폴더마다 플라스틱 교수형 파일 폴더, 두 파우치를 삽입하고, 수직 위치에있는 랙에 폴더를 배열합니다. 25-28의 온도 ° C와 16 H 라이트 / 8 H 어둠의 사이클에서 관리하고 통제된-환경 챔버에서 선반을 놓으십시오. 랙도 온실에서 유지하지만, 곰팡이 오염에 대한 가능성을 줄이기 위해, 호일이나 식물 줄기의 양쪽에 선반 위에 놓여 빳빳한 종이 커버를 요구할 수 있습니다.
- 역삼투에 물을 한두 번 하루에 물은 파우치. 시딩 후 14-10 일 정도는 차 루트 도움말을 통해 적절한 루트 시스템이 개발되면 (그림 1), 묘목은 접종을위한 준비가되어 있습니다.
3. 선충류의 달걀의 추출
전자의 추출감염된 뿌리에서 ggs은 Hussey와 바커 (1973)에 의해 개발된 프로토콜에서 수정됩니다.
- 3 ~ 사일 선충류의 접종 전에 감염된 토마토 뿌리에서 루트 매듭 선충류 달걀 압축을 풉니다. 계란 추출을 시작하기 전에 오염을 피하기 위해 뜨거운 물로 철저하게 작업 영역을 씻는다. 또한 뜨거운 물에 씻어 믹서기, 두 양동이, 와이어 메쉬 지원, 고무 망치, 425 세 sieves, 90 및 25 μm의 개구, 눈금 실린더와 가위.
- 425, 90 및 25 μm의 개구 다음 순서로 위에서 아래까지 sieves를 스택. 계란은 하단에 25 μm의 정보 체에 수집됩니다. 싱크에서 지원 와이어 메쉬에 sieves 올려. 실행을 통해 솔루션을 수집하기 위해 철망 아래 양동이 놔.
- inoculum의 원본으로 사용 감염된 식물 (들)의 꼭대기를 잘라, 그리고 버리고. 조심스럽게 화분에서 식물을 제거하십시오. 물이 가득 플라스틱 양동이에 수영으로 뿌리를 씻는다. 실행 아래에서 더욱 뿌리를 씻어토양 입자가 뿌리로부터 씻겨 때까지 물을 닝.
- 작은 조각으로 가위로 뿌리를 잘라. 직근 처분.
- 뚜껑이있는 커다란 플라스틱 항아리에서 단일 공장에서 다진 뿌리를 넣어 뿌리를 덮어 뚜껑을 닫습 충분 10 % 표백제 솔루션을 추가합니다.
- 2 분에 대한 뿌리가 들어있는 항아리를 흔들어.
- 항아리를 열고 맨 체를 향해 뿌리를 기름을 붓고 피부 노즐에 연결된 호스로 씻는다. 모든 표백제 냄새가 사라질 때까지 잘 씻는다. 체의 모공을 막힘 방지하기 sieves의 측면을 생략하고 망치를 사용하십시오.
- 상단 체를 제거하고 두 번째 체의 파편을 린스.
- 두 번째 체를 제거하고 마지막 체에서 계란을 포함 미세 파편을 수집합니다. 물통에서 완만한 스트림으로 체 중 한쪽으로 파편을 이동합니다. 물의 최소 금액과 깨끗한 비커에 파편과 계란을 수집합니다.
- 체에 한 번 더 물은에서 수집한탈출 수있는 모든 계란을 수집하기 위해 25 μm의 정보 체를 통해 버킷. 물로 잘 씻어과 같은 비이커에 수집합니다.
- 맨 체에서 식물 파편을 취소하고 가압 물로 깨끗이 세 sieves 씻는다. 그것은 기공 크기를 왜곡 수 있으므로 sieves의 메쉬 부분을 만지지 마십시오.
4. 부화 선충류의 계란
- 라인은 깨끗한 금속 Kimwipe 종이를 몇 가지 레이어가있는 바구니와 유리 페트리 접시에 잘 맞습니다. 바구니와 접시의 바닥 사이에 1 cm 거리를 허용합니다.
- 와이어 바구니에 종이쪽으로 추출 선충류 달걀을 붓고. 철사 바구니의 바닥이 물 표면을 만지는하지만 물속에 포장되어 있지 않도록 충분한 액체를 추가합니다. 플라스틱 뚜껑으로 상단을 커버.
- 매일 물의 증발을 확인하고 바구니의 바닥은 물이 닿으 있도록 페트리 접시에 물을 추가합니다. 이것은 밖으로 건조에서 계란을 방지할 수 있습니다.
- 격일로, 구미시를 수집비커에 페트리 접시에서 J2s을 포함 ter. 즉시 사용하지 않을 경우, 수족관 펌프에 의해 생성된 실험실 공기 공급 장치 또는 공기를 사용하여 실온에서 수집한 inoculum를 공기에 쐬다. 2 일 이내 aerated inoculum을 사용합니다. J2s은 6-8일 걸쳐 설정 부화에서 수집한 수 있습니다.
5. 냄비 또는 트레이와 감염에 대한 평가에서 토마토 루트 감염
- 계수 슬라이드 또는 접시에 J2s의 수를 세어 수집 nematodes 세 aliquots를 사용하여 평균을 계산하고 접종에 대해 원하는 볼륨을 결정합니다. 일반적으로 3,000 J2s은 냄비와 묘목 트레이 재배 식물 500 J2s에 공장 당 사용됩니다.
- 낮은 속도로 자기 저어 접시 inoculum를 저어.
- 당신이 식물을 접종하기 전에 토양이 습한지만, 너무 무리하지 않았는지 확인합니다. 냄비 접종의 경우 (그림 2 연필을 사용하여 각 토마토 루트 시스템 주변 모래 사장에 대한 반 냄비 깊이의 세 구멍을
- 트레이의 높은 처리량 화면의 경우 토양에 J2s를 제공하는 pipetter 따라 5 ML 피펫 팁 (그림 3)에 붙어 양쪽에 구멍 수정된 봉인된 팁 바늘을 사용합니다. 또는 nematodes는 단계 5.3에서와 같이 전달할 수 있습니다.
- 24-27에서 온실에서 식물을 유지 ° C 6~8주입니다. 촉진제로 회 비옥하게하기 위해 계속합니다.
- 감염의 평가 내용은 조심스럽게 화분에서 식물을 제거하고 뿌리를 (같은 단계 3.3에서 설명) 씻는다.
- 15 분 동안, 1 MG / L erioglaucine에 뿌리를 잠수함이 잠수하여 청색 계란 대중을 청바지.
- 물속에 뿌리를 씻어 및 개별 루트 시스템의 스테인드 계란 질량을 계산하여 평가합니다. 조명 데스크 확대경은 계란 대중을 시각화하기 위해 사용될 수 있습니다.
- 스크린 식물이 더 g 필요한 경우enetic 연구, 평가에 대한 뿌리를 세척하기 전에 꼭대기를 잘라하지 않습니다. 계란 대중을 더럽히는 것과 집계 후 온실에서 유기 토양에 묘목을 이식 증산을 줄이기 위해 크게 꼭대기를 치다 및 유지.
6. 파우치 및 감염의 평가에 Cowpea 루트 감염
- 선충류의 inoculum 백작과 앞에서 설명한대로 자기 저어 접시에 저어.
- 수평 표면에 매달려 폴더와 장소에서 파우치를 제거합니다. 5 ML 1500 J2s 각 주머니의 예방. 주머니의 플라스틱 커버를 들고 뿌리의 표면 위에 균일하게 nematodes을 배포합니다.
- 빛을 제외 어두운 종이로 덮여 접종 후 24 H에 대한 수평 위치에 파우치 보관 후 성장 챔버에 매달려 폴더로 돌아갑니다.
- 표 1; 절반 강도 Hoagland의 솔루션 (Hoagland & Arnon 1950 년 함께 한 두 번 매일 필요에 따라 물이 식물,
- 약 30 일 (범위 28~35일) 접종 후, 75 MG / L erioglaucine의 10-20에 대한 ML 각 주머니를 불어 넣다. 하룻밤 수평 위치에 색소 과다 분비 파우치 보관하십시오.
- 파우치를 분출과 조명 책상 확대경 아래에 계란 질량을 계산하여 루트 시스템을 평가합니다.
- 스크린 식물이 더 유전 연구 또는 번식 작업에 필요한 경우에는 신중하게 온실에서 화분에서 유기농 토양에서 종이, 이식에서 뿌리를 꺼내 유지.
7. 대표 결과
설명한 두 시스템에 대한 선충류 예방 접종을위한 토마토와 cowpea 식물의 적절한 단계는 그림에 표시됩니다1과 2. 또한, 토마토와 cowpea의 잘 감염된 뿌리의 예제는 그림 4와 5에 표시됩니다. 대부분의 질병 저항 화면에서와 마찬가지로, 그것은 감염 속도의 평균을 계산하는 선충류의 접종에 대한 유전자형 당 적어도 6-10 식물을 사용하는 것이 좋습니다. 식물 사이의 선충류 감염의 변동은 동일한 유전자형으로 인해 균일한 식물의 크기와 정확한 금액과 inoculum의 전달을 사용하여 줄일 수 있습니다.
쟁반과 성장 파우치의 사용은 작은 성장 공간에서 식물의 수천 수백의 심사를 가능하게합니다. 성장 파우치도 닦고 뿌리 (그림 4)에 대한 필요성과 루트 매듭 선충류 감염의 신속하고 효율적인 비파괴 평가를 허용합니다.
그림 1. 두 주간 된 cowpea 공장 주머니 재배 및 루트 - 매듭 NEMA 준비접종 tode.
그림 루트 - 매듭 선충류의 접종에 대해 2. 세 주일 오래된 토마토 공장 준비 완료.
그림 3. nematodes의 높은 처리량 접종에 사용되는 수정 바늘과 피펫 팁. 바늘의 아래쪽은 봉인되어 구멍이 세 가지 세트는 레이저 빔을 이용하여 바늘로 뚫고 있었다. 그런 다음 수정된 바늘은 5 ML 피펫 팁에 붙어되었다.
그림 4. 루트 - 매듭 nematodes에 감염된 토마토 루트 시스템.
그림 5. 30 일 이후의 접종에서 재배 erioglaucine 물들일 계란 대중과 cowpea 루트 시스템28 ° C.
Discussion
고도로 infective의 inoculum과 적절한 발달 단계에서 식물 사용의 준비 : 성공적으로 선충류 화면의 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 루트 매듭 선충류 달걀의 부화 비율은 5 사이의 높은 변수 및 범위는 - 50 %. 따라서 해치와 고도로 infective의 J2s의 최적 수준을 얻기 위해, 가까운주의 계란 추출 및 부화 절차에 지불되어야합니다. 달걀은 최소한의 기간 동안 표백제에 노출되어야하며 표백제를 루트 혼합물에서 잘 씻어서 아웃해야합니다. 언제 부화 계란, 계란을 포함하는 슬러리는 물속에 잠수해서는 안됩니다. 또한, 부화 점이 수집되는 기본 페트리 접시에 계란을 흘리게하지 마십시오. 부화 과정에서 달걀을 흘리고 피하는 방법 중 하나는 종이 깰 수도로 Kimwipe에 직접 물을 추가하지 않는 것입니다. 대신 배양 접시에 직접 물을 추가합니다.
최상의 결과를 얻으려면 신선한 부화 J2s을 사용합니다. 만약 hatcH 속도가 낮은 많은 inoculum이 필요, J2s는 더 이상 기간 동안 15 ° C에서 저장할 수 있습니다. 접종 이전 nematodes를 재생 상온에 보관 inoculum을 따뜻하게. 그러나, 심지어는 15 연장 기간 동안 J2s를 저장하지 ° C에서 굶주린 J2s 효율적으로 감염하지 않습니다.
어린 모종은 뿌리 - 매듭 선충류의 접종위한 최상의 발달 단계입니다. 그러나이 J2s에 대한 진입 점으로 루트 팁 충분한 숫자를 제공하는 적절한 루트 시스템의 형성과 균형 있어야합니다. 최적의 식물의 성장 상태를 유지하면 화면에 중요합니다. 특별히 파우치 재배 이들을 이상을 돋구는 식물을 피하십시오. 파우치를 과잉 물을 같은 곰팡이의 성장을 촉진하고 뿌리 건강을 축소 수 파우치의 바닥에 물을 서로 표시.
assays 추가 선충류 감염의 평가와 계란 / 뿌리 시스템과 달걀의 개수의 계산 모두와 / g fre의쉬 루트가 수행할 수 있습니다. 토마토 assays 경우, 각각의 뿌리는 무게 있으며 추출한 계란은 inoculum 준비 (섹션 3)에 대해 설명했다. 식물 샘플 수의 처리하면 개별 루트 시스템은 계란 추출을위한 믹서를 사용하여 분해 수 있습니다. 계란의 수는 적어도 세 aliquots에 포함하고 신선한 뿌리 시스템의 계란 / g이 계산되어야한다. 주머니 assays 들어, 루트 시스템은 종이 삽입을 해봤 무게, 달걀이 추출됩니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
Kaloshian 연구실의 연구는 식량 농업의 미국 국립 연구소 (2007-35607-17765)에서 교부금에 의해 자금 지원을하고 있습니다. 로버츠 연구소의 연구는 국제 개발을위한 미국 기관에서 보조금 (GDG-G-00-02-00012-00 및 EDH--00-07-00005)과 캘리포니아 드라이 빈 자문위원회가 후원한다.
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